基于p62的腫瘤疫苗的初步研究.pdf

1、近來研究發(fā)現(xiàn)，p62作為多種信號傳導(dǎo)途徑中的支架蛋白，能通過C末端泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域（ubiquitin-associated domains，UBA）與泛素化靶蛋白結(jié)合，并通過LRS（LC3 recognition sequence，LRS）結(jié)構(gòu)域與LC3結(jié)合，然后由LC3介導(dǎo)將泛素化靶蛋白包裹入自噬小體，最后自噬小體與溶酶體融合完成蛋白的降解。因此，p62在兩種蛋白降解途徑（蛋白酶體降解途徑和自噬降解途徑）之間發(fā)揮著重要的橋梁作用。

2、r>　　 本研究擬構(gòu)建p62蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后表達(dá)并純化p62蛋白，為制備抗p62抗體及細(xì)胞內(nèi)p62蛋白的檢測提供基礎(chǔ)。
　　 目的：構(gòu)建p62蛋白的原核表達(dá)載體，原核表達(dá)并純化p62蛋白。
　　 方法：
　　 1.pET28a（+）-p62質(zhì)粒的構(gòu)建：PCR擴(kuò)增p62蛋白的編碼基因片段，雙酶切后插入pET28a（+）載體，轉(zhuǎn)化細(xì)菌后采用PCR、酶切、DNA序列測定等方法，鑒定pET28a（+）-p6

3、2質(zhì)粒；
　　 1.將pET28a（+）-p62質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌，誘導(dǎo)p62表達(dá)。通過SDS-PAGE檢測探討誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度等因素對p62表達(dá)的影響；
　　 2.運(yùn)用His-Bind樹脂純化p62蛋白并用Western Blot方法進(jìn)行純化鑒定。
　　 結(jié)果：
　　 1.1經(jīng)PCR、酶切、DNA序列測定等方法證實(shí)，成功構(gòu)建了p62蛋白的原核表達(dá)載體-pET28a（+）-p62質(zhì)粒；
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