2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:自噬是細胞內(nèi)通過溶酶體途徑吞噬、降解老化的細胞器或入侵的細菌,病毒等,在細胞的生長,分化,抵御外界刺激,質(zhì)量平衡方面發(fā)揮著重要的作用。但是如果自噬不足或自噬障礙則與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。此外,目前自噬狀態(tài)或改變在慢性鼻鼻竇炎伴鼻息肉的疾病中研究的很少。
  研究目的:研究自噬流相關(guān)蛋白在慢性鼻竇炎伴鼻息肉中定位及表達,以及其與上皮細胞凋亡的研究。
  研究方法:(1)免疫組化及免疫印記方法(western blot;

2、 WB)檢測慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織及上皮細胞中自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達:與自噬相關(guān)的蛋白包括:微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3β-Ⅱ(microtubule-associated protein1 light chain3B(LC3B)-Ⅱ),自噬相關(guān)蛋白3,5,7(autophagy-related protein(Atg)3, Atg5, Atg7);B淋巴細胞-2相互作用蛋白(Bcl-2 interacting protein; Becl

3、in1);底物蛋白p62蛋白,泛素化蛋白(ubiquitinated protein);溶酶體標志物:溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein1; LAMP-1).凋亡相關(guān)蛋白包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3,-8(cysteine-aspartic protease(caspase)-3;caspase-8);聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polym

4、erase;PARP).
  (2)電鏡觀察慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉組織及上皮細胞自噬體及自噬溶酶體數(shù)量的改變。
 ?。?)western blot檢測慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細胞中自噬流的變化:分別用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1;Baf A1)和自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin; Rapa)來刺激慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細胞,觀察自噬流(LC3B, p62)及凋亡(cleaved PARP

5、)的改變。
 ?。?)western blot檢測siNS或sip62后慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮細胞中凋亡的改變:用20 nM siNS或 sip62轉(zhuǎn)染鼻息肉上皮細胞,48小時后觀察 p62, caspase-8, caspase-3的表達變化。
  (7)刺激BEAS-2B細胞系篩選引起鼻息肉上皮細胞中自噬不足的上游因子:分別用白介素(interleukin(IL)-4,-13,-17A)或干擾素-γ(interfer

6、on–gamma;IFN-γ)或聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyinosinic: polycytidylic acid;poly(I:C);dsRNA), or脂多糖(lipopolysaccharides;LPS)刺激BEAS-2B細胞系,western blot觀察LC3B, p62, ubiquitinated proteins,及凋亡的改變。
 ?。?)篩選出的INF-γ刺激正常鼻粘膜上皮細胞(nasal epithelia

7、l cells;NECs)觀察自噬和凋亡的改變:用IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮細胞(NECs),通過western blot檢測觀察LC3B, p62, ubiquitinated proteins的表達,western blot及Anexin V/PI觀察凋亡的改變。
  (9) IFN-γ刺激后WB檢測正常鼻粘膜上皮細胞中自噬流的變化:用rapamycin預先處理上皮細胞3小時后,再用IFN-γ刺激,或先IFN-γ刺激上皮細胞

8、24小時,于收集細胞前加入bafilomycin A1刺激3小時,western blot檢測自噬流(LC3B, p62)及cleaved PARP的改變;Anexin V/PI檢測凋亡的改變。
  (10)轉(zhuǎn)染siNS或sip62, siAtg5到正常鼻粘膜上皮細胞,再IFN-γ刺激后觀察p62及凋亡的改變:轉(zhuǎn)染20 nMsiNS或sip62,或60 nMsiAtg5到正常鼻粘膜上皮細胞后,再IFN-γ刺激24小時,觀察p62蛋

9、白及凋亡的改變。
  研究結(jié)果:(1)自噬相關(guān)蛋白LC3B-II, Atg3, Atg5, Atg7, Beclin1;自噬底物蛋白p62, ubiquitinated蛋白;溶酶體標記物 LAMP-1,以及凋亡相關(guān)蛋白 cleaved caspase-8, caspase-3and PARP在嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎的組織,及鼻粘膜上皮細胞中,相較于正常組,均表達增加。
 

10、 (2)加入自噬抑制劑bafilomycin A1引起鼻息肉上皮細胞中LC3B-Ⅱ,p62, cleaved PARP的蛋白表達水平均升高,而加入自噬激動劑rapamycin僅引起LC3B-Ⅱ輕微升高,p62, cleaved PARP相應(yīng)的出現(xiàn)輕微的降低,均相對于對照組無統(tǒng)計學意義,提示在鼻息肉上皮細胞中自噬是升高的,而且自噬流的通路是無障礙的。
  (3)用轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染sip62到鼻息肉上皮細胞中,我們觀察到相應(yīng)的外源性的凋亡

11、通路cleaved caspase8, cleaved PARP的蛋白水平均出現(xiàn)降低。
  (4)分別用白介素 IL-4, IL-13, IL-17A或 IFN-γ或 dsRNA,或 LPS刺激BEAS-2B細胞系,篩選出 INF-γ可能是鼻息肉上皮細胞中自噬不足的上游影響因素。再用INF-γ刺激氣液界面培養(yǎng)的正常原代鼻黏膜上皮細胞,我們發(fā)現(xiàn)與刺激BEAS-2B細胞系的結(jié)果類似,自噬標志蛋白LC3B-Ⅱ出現(xiàn)增高;而其底物蛋白p62

12、, ubiquitinated蛋白反而也出現(xiàn)增高。為進一步證實是否存在自噬不足,我們再次加入自噬抑制劑bafilomycin A1到INF-γ刺激的正常鼻粘膜上皮細胞,發(fā)現(xiàn)上皮細胞中LC3B-Ⅱ,p62, cleaved PARP的蛋白表達水平均升高,而加入自噬激動劑rapamycin僅引起LC3B-Ⅱ輕微升高,p62, cleaved PARP相應(yīng)的出現(xiàn)輕微的降低,均相對于對照組無統(tǒng)計學意義,IFN-γ刺激正常鼻粘膜上皮細胞與鼻息肉上

13、皮細胞出現(xiàn)的自噬不足的狀態(tài)類似。
  (5)為進一步證實 IFN-γ通過 p62蛋白誘導上皮細胞凋亡,我們分別 sip62或siAtg5到正常鼻粘膜原代上皮細胞,再用IFN-γ刺激。我們發(fā)現(xiàn)sip62+IFN-γ相較于siNS+IFN-γ,cleaved PARP及capase-8的表達明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義;而siAtg5后p62表達上調(diào),所以siAtg5+IFN-γ相較于siNS+IFN-γ,cleaved PARP及c

14、apase-8的表達明顯增加,差異具有統(tǒng)計學意義。所以在鼻粘膜上皮細胞中IFN-γ可能通過p62蛋白影響上皮細胞凋亡。研究結(jié)論:1. IFN-γ在嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎組織中均表達增高。而且凋亡在嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎和非嗜酸粒細胞性伴鼻息肉的慢性鼻-鼻竇炎上皮細胞中均表達增高。
  2.增高的IFN-γ可能通過誘導自噬不足引起 p62蛋白的上調(diào),進而通過增高的p

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