基于樹(shù)突狀細(xì)胞的膀胱腫瘤疫苗的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、膀胱腫瘤是我國(guó)泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，其中多數(shù)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌。膀胱腫瘤的主要特點(diǎn)是復(fù)發(fā)率高，可能的原因是膀胱腫瘤患者膀胱粘膜局部免疫功能低下，使得殘存腫瘤容易逃避免疫監(jiān)視，得以生存和形成復(fù)發(fā)。因此，非肌層浸潤(rùn)性膀胱腫瘤術(shù)后常輔以膀胱灌注化療或免疫療法以預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展?？ń槊?BacillusCalmette-Guerin，BCG)膀胱灌注是目前投入臨床應(yīng)用最有效的免疫治療方法，有效激活膀胱粘膜局部免疫應(yīng)答是其抗腫瘤作用的主要機(jī)制

2、，但BCG膀胱灌注等治療仍不能完全預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展。預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展仍是尚未完全解決的難題。 樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)功能最強(qiáng)，也是唯一能激活初始型T淋巴細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞(APC)。DC在腫瘤免疫中的功能強(qiáng)大，但腫瘤組織及外周血中DC的數(shù)目、成熟及功能受到抑制。隨著體外大量擴(kuò)增DC和制備DC疫苗技術(shù)的日趨成熟，采用DC疫苗進(jìn)行抗腫瘤治療已成為當(dāng)今腫瘤生物治療領(lǐng)域倍受關(guān)注的焦點(diǎn)之一。 環(huán)氧化酶2(CO

3、X-2)是一種誘導(dǎo)型酶，正常組織幾乎無(wú)表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，對(duì)腫瘤的分化、凋亡、血管生成等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，且與腫瘤分級(jí)分期、進(jìn)展預(yù)后等有關(guān)。因此，近年來(lái)，COX-2抑制劑作為膀胱腫瘤治療的新型途徑，獲得了廣泛的關(guān)注。我們?cè)囼?yàn)組也進(jìn)行了大量相關(guān)的研究工作，發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑對(duì)膀胱腫瘤有明顯的殺傷與抑制增殖的作用，同時(shí)對(duì)DC細(xì)胞具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)作用。 CpG是卡介苗(BCG)中提取的DNA片段，以未甲基化胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤

4、(CpG)二核苷酸為核心的六堿基序列為基礎(chǔ)，具有強(qiáng)大的免疫刺激活性。人工合成的含CpG序列的寡脫氧核糖核苷酸(CpG-ODN)具有與細(xì)菌DNA相同的免疫活性，可與DC表面TLR-9受體特異性結(jié)合，激活DC，上調(diào)共刺激分子的表達(dá)、增強(qiáng)DC向T細(xì)胞遞呈抗原的能力，可以替代BCG使DC成熟獲得抗原遞呈和刺激免疫的功能。 本實(shí)驗(yàn)組近年來(lái)在COX-2與膀胱腫瘤的相關(guān)研究以及CpG-ODN聯(lián)合DC疫苗的研究都進(jìn)行了大量的工作，本課題是本實(shí)驗(yàn)

5、室前期相關(guān)研究延續(xù)和深入。課題研究的目的在于建立以DC為基礎(chǔ)，以COX-2抑制劑和免疫佐劑CpG-ODN刺激誘導(dǎo)其成熟并發(fā)揮免疫功能的膀胱腫瘤疫苗，研究其對(duì)膀胱腫瘤的生物學(xué)效應(yīng)，為尋找一種新的治療膀胱癌和預(yù)防其復(fù)發(fā)的方法奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本研究主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 第一部分基于DC的膀胱腫瘤疫苗的建立及其形態(tài)與功能的初步鑒定。 目的：建立基于DC的膀胱腫瘤疫苗并進(jìn)行初步鑒定。 方法： 1.從人臍

6、血中分離單個(gè)核細(xì)胞，體外誘導(dǎo)培養(yǎng)為樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)，加入COX-2抑制劑塞來(lái)昔布和免疫佐劑CpG-ODN，刺激使其成熟，制備膀胱腫瘤疫苗。觀察其形態(tài)并對(duì)其表面標(biāo)志進(jìn)行檢測(cè)。 2.ELISA法測(cè)定各組培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子(IL-12)和Th2型細(xì)胞因子(IL-10)水平。 3.MTT法測(cè)定各組DC的同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)性。 結(jié)果和結(jié)論： 1.經(jīng)鑒定建立的以DC為基礎(chǔ)的膀胱腫瘤疫苗具有典型DC形態(tài)

7、學(xué)和表型特征。 2.細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示BCG激活DC后IL-12和IL-10水平均較對(duì)照組顯著升高，表明BCG既激活了Th1型，也激活了Th2型免疫應(yīng)答，而加入塞來(lái)昔布的2組DC的細(xì)胞因子IL-12分泌顯著增加而IL-10表達(dá)明顯下降，證實(shí)了塞來(lái)昔布引起的免疫漂移現(xiàn)象。同時(shí)，應(yīng)用佐劑CpG-ODN也可以見(jiàn)到IL-12的分泌明顯增加，但對(duì)IL-10的分泌沒(méi)有明顯影響。 3.同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組M

8、LR明顯比對(duì)照組增強(qiáng)。 這些結(jié)果都初步顯示了我們制備的DC疫苗具有更強(qiáng)的抗原遞呈效應(yīng)和誘導(dǎo)機(jī)體免疫的效應(yīng)，為我們進(jìn)一步驗(yàn)證DC疫苗的生物效應(yīng)和動(dòng)物試驗(yàn)打下了良好的基礎(chǔ)。 第二部分 DC疫苗對(duì)體外培養(yǎng)的膀胱腫瘤細(xì)胞株T24的免疫學(xué)效應(yīng)研究。 目的：觀察建立的DC疫苗對(duì)體外培養(yǎng)的膀胱腫瘤T24細(xì)胞的免疫治療效應(yīng)。 方法： 1.制備DC疫苗激活的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)；復(fù)蘇和培養(yǎng)人膀胱腫瘤T24細(xì)胞

9、作為CTL的靶細(xì)胞。 2.將貼壁生長(zhǎng)的T24細(xì)胞，分別與各組DC疫苗共培養(yǎng)，乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測(cè)定各組DC激活的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)人膀胱腫瘤細(xì)胞株T24的細(xì)胞毒活性。 結(jié)果和結(jié)論： 1.成功復(fù)蘇和擴(kuò)增了靶細(xì)胞T24，成功獲得了DC疫苗激活的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)。 2.LDH釋放法測(cè)定各組DC激活CTL對(duì)人膀胱腫瘤細(xì)胞株T24的細(xì)胞毒活性，我們制備的DC疫苗激活CTL，產(chǎn)生很強(qiáng)的抗膀

10、胱腫瘤細(xì)胞毒活性的效應(yīng)。 隨著效/靶比提高，細(xì)胞毒活性辦相應(yīng)加強(qiáng)。由此可以推斷我們制備的DC疫苗可能成為膀胱腫瘤的有效治療方法。 第三部分負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗對(duì)T739小鼠體內(nèi)膀胱腫瘤的免疫學(xué)效應(yīng)研究。 目的：觀察建立的DC疫苗對(duì)BTT739膀胱腫瘤荷瘤小鼠體內(nèi)膀胱腫瘤的免疫治療效應(yīng)。 方法： 1.采用細(xì)胞懸液法建立BTT739膀胱腫瘤荷瘤小鼠模型，分別于接種腫瘤細(xì)胞后第7天和14天，應(yīng)用負(fù)載腫

11、瘤抗原的DC疫苗腫瘤周圍注射，觀察腫瘤的體積、瘤重、荷瘤小鼠的生存期等變化。 2.經(jīng)負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗治愈的2只小鼠，30天后仍無(wú)腫瘤生長(zhǎng)，再次皮下接種BTT739細(xì)胞，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。 結(jié)果和結(jié)論： 1.負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠腫瘤平均體積和平均瘤重均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，生存期長(zhǎng)于對(duì)照組，并且有2只小鼠無(wú)瘤長(zhǎng)期存活；負(fù)載腫瘤抗原的DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN對(duì)膀胱腫瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效

12、應(yīng)和生存期延長(zhǎng)作用。 2.經(jīng)DC疫苗實(shí)驗(yàn)組治愈的2只小鼠30天后無(wú)腫瘤生長(zhǎng)，再次皮下接種BTT739細(xì)胞觀察30天仍無(wú)腫瘤發(fā)生。我們建立的DC疫苗對(duì)膀胱腫瘤細(xì)胞再次攻擊具有免疫保護(hù)作用，其機(jī)制可能是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了長(zhǎng)期的腫瘤記憶性細(xì)胞免疫反應(yīng)，在膀胱腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)防中具有良好應(yīng)用前景。 全文結(jié)論： 1.建立了以DC為基礎(chǔ)，以COX-2抑制劑和免疫佐劑CpG-ODN刺激其誘導(dǎo)成熟的膀胱腫瘤疫苗，其具有和普通DC相同的細(xì)胞