鼠疫黏膜佐劑疫苗的初步研究.pdf

1、大多數(shù)感染因子是通過黏膜進(jìn)入動物和人體的。因此，黏膜免疫的預(yù)防接種技術(shù)顯得很重要。研究表明霍亂毒素B亞單位(choleratoxinB，CTB)、蛋白體(proteosomes)和protollin是比較有效的黏膜佐劑。蛋白體中的PorA、PorB和Class4類蛋白分子佐劑效應(yīng)的研究對于開發(fā)新黏膜佐劑和對蛋白體作用機(jī)制的研究有重要的意義。 鼠疫在全世界范圍內(nèi)有死灰復(fù)燃之勢，近年來中國已暴發(fā)數(shù)次小規(guī)模的人間鼠疫。在各種鼠疫疾病之

2、中，尤以肺鼠疫破壞最大。為了能達(dá)到長期起效的目的，對肺鼠疫提供全面和長久的保護(hù)，鼠疫黏膜佐劑疫苗的研究是十分必要和重要的。 本研究從B群2b型腦膜炎奈瑟氏雙球菌中提取蛋白體佐劑；從福氏2a痢疾桿菌中提取脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，與蛋白體復(fù)合制備protollin佐劑；基因重組了CTB佐劑和用于黏膜佐劑研究的PorA，PorB和Class4蛋白，為制備鼠疫F1-V黏膜佐劑疫苗提供可靠的黏膜佐劑，進(jìn)一

3、步探討滴鼻免疫Balb/c小鼠后誘導(dǎo)的免疫效果。通過比較篩選出最有效的鼠疫黏膜佐劑疫苗和佐劑分子。 1.通過不同條件的優(yōu)化，從B群2b型腦膜炎奈瑟氏雙球菌中成功提取了高純度的蛋白體，經(jīng)蛋白質(zhì)指紋圖譜(MALDI-TOF-MS)鑒定鑒定為腦膜炎B群2b型奈瑟氏雙球菌外膜蛋白的PorA，PorB和Class4孔道膜蛋白，相對分子量分別為41ku，38ku和34ku。經(jīng)檢測蛋白體中內(nèi)毒素含量，核酸含量，莢膜多糖的含量都低于樣品的1％。

4、鼠疫F-V抗原與蛋白體佐劑分別以4：1，2：1，1：1，1：2和1：4在4℃疏水合成疫苗，滴鼻免疫小鼠。結(jié)果蛋白體佐劑不僅提高鼠疫F1-V抗原的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，而且能誘導(dǎo)小鼠呼吸道、消化道和生殖道等局部黏膜免疫應(yīng)答。通過比較，抗原和佐劑劑量比例在4：1時免疫效果最佳。用100LD50的鼠疫141強(qiáng)毒株進(jìn)行腹腔攻毒，蛋白體佐劑疫苗獲得了67％的保護(hù)。 2.從福氏2a痢疾桿菌中提取了LPS，將LPS脫毒，經(jīng)檢測其中的蛋白質(zhì)含量，核酸含

5、量符合生物制品要求，具有良好的抗原性。將LPS與蛋白體制備成protollin佐劑，與鼠疫F1-V抗原制備疫苗滴鼻免疫小鼠，結(jié)果protollin佐劑比蛋白體能顯著提高鼠疫F1-V抗原的系統(tǒng)免疫水平和黏膜免疫水平，而單獨(dú)的LPS不具有免疫增強(qiáng)作用。 3.通過PCR技術(shù)從埃爾托霍亂弧菌獲得CTB的基因序列，將其克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)，基因測序正確。在IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌中表達(dá)，獲得純化的CTB蛋白。免疫印跡試驗(yàn)鑒

6、定具有良好的免疫原性。鼠疫F1-V抗原與rCT-B佐劑以5：2、5：1、1：1和1：2混合成疫苗，滴鼻免疫小鼠。結(jié)果不同比例疫苗組都能誘導(dǎo)較高、較快的血清IgG、IgA和黏膜sIgA。相比之下，5：1疫苗組能誘導(dǎo)更強(qiáng)的系統(tǒng)免疫和黏膜免疫。用100LD50的鼠疫141強(qiáng)毒株進(jìn)行腹腔攻毒，rCTB佐劑疫苗保護(hù)率為0。 4.PorA、PorB和Class4類蛋白分子是蛋白體佐劑的主要成分，所以對它們佐劑作用的研究將會成為疫苗佐劑領(lǐng)域研

7、究的新進(jìn)展。根據(jù)基因文庫中提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，以B群2b型腦膜炎奈瑟氏雙球菌為模板獲得基因序列，將其克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)構(gòu)建質(zhì)粒，基因測序正確。在IPTG誘導(dǎo)下，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高純度的重組蛋白，免疫印跡試驗(yàn)鑒定具有良好的免疫原性。鼠疫F1-V抗原與PorA、PorB和Class4重組蛋白4：1混合成疫苗，滴鼻免疫小鼠。結(jié)果Class4蛋白具有與蛋白體同等的作用，能顯著提高鼠疫F1-V黏膜疫苗的系統(tǒng)免疫應(yīng)答和

8、黏膜免疫應(yīng)答，而PorA、PorB的免疫佐劑作用不顯著。這在疫苗佐劑的研究中是一個新的視點(diǎn)。 5.通過對rCTB佐劑疫苗、蛋白體佐劑疫苗和rCTB佐劑加入蛋白體-鼠疫F1-V佐劑疫苗免疫效果的研究比較，結(jié)果rCTB佐劑加入蛋白體-鼠疫F1-V佐劑疫苗的體液免疫應(yīng)答最高，而rCTB佐劑疫苗的黏膜應(yīng)答水平顯著高于其它兩組，蛋白體疫苗獲得了更全面的免疫應(yīng)答包含有天然的免疫應(yīng)答。用100LD50的鼠疫141強(qiáng)毒株進(jìn)行腹腔攻毒，蛋白體佐劑