年齡相關(guān)性黃斑變性轉(zhuǎn)錄組表達(dá)特征及臨床治療研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 年齡相關(guān)性黃斑變性患者與健康人基因表達(dá)譜差異分析
　　目的:
　　通過對年齡相關(guān)性黃斑變性患者與健康人基因表達(dá)譜的差異性分析，得出可能與AMD發(fā)病相關(guān)的基因，并進(jìn)行功能學(xué)分析。
　　方法:
　　基于NCBI GEO數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，原始芯片數(shù)據(jù)來源GEO數(shù)據(jù)庫收錄的GSE76237與GSE29801表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。其中GSE7623

2、7包含14例年齡相關(guān)性黃斑變性病人與15例健康正常人的單核細(xì)胞，采用Affymetrix Gene1.0 ST芯片進(jìn)行表達(dá)譜分析;GSE29801包含177例年齡相關(guān)性黃斑變性患者捐贈者視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜組織樣本與118例沒有眼部疾病的捐贈者的視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜組織樣本，采用Agilent-014850 Whole Human GenomeMicroarray4x44K G4112F表達(dá)譜芯片進(jìn)行檢測。本次分析分別從全血單核細(xì)胞表達(dá)譜芯片與病變

3、組織樣本表達(dá)譜芯片兩個角度進(jìn)行數(shù)據(jù)整合分析，數(shù)據(jù)分析方法包括:1、芯片數(shù)據(jù)歸一化分析:Bioconductor limma package;2、差異基因分析:Bioconductor limma package;3、GO與KEGG功能富集分析:WEB-basedGene Set Analysis Toolkit;4、繪圖:R語言，得出差異性表達(dá)基因(Differentiallyexpressed genes，DEGs)，并進(jìn)行這些差異性

4、表達(dá)基因的功能學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.通過對AMD患者與健康正常人全血單核細(xì)胞表達(dá)譜芯片進(jìn)行生物信息學(xué)分析，按照差異倍數(shù)大于1.5以及矯正后的p值小于0.05進(jìn)行差異性基因篩選，總共獲得111個差異性表達(dá)基因，上調(diào)表達(dá)基因28個，下調(diào)表達(dá)基因83個。其中差異倍數(shù)大于2倍的差異性表達(dá)基因8個，上調(diào)表達(dá)2個，下調(diào)表達(dá)6個。
　　2.AMD患者外周血單個核細(xì)胞差異表達(dá)基因基因本體學(xué)(Gene ontology，GO)功

5、能富集分析結(jié)果顯示，差異性表達(dá)基因參與的主要生物學(xué)功能包括白細(xì)胞活化、淋巴細(xì)胞活化、T細(xì)胞活化以及T細(xì)胞募集等。
　　3.AMD患者外周血單個核細(xì)胞差異性表達(dá)基因KEGG(Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes)富集分析結(jié)果顯示，差異性表達(dá)的基因主要參與造血細(xì)胞、T細(xì)胞受體通路、Th1 and Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化以及原發(fā)性免疫缺陷等信號通路。
　　結(jié)論:
　　1.AM

6、D患者和對照組之間外周血單個核細(xì)胞的基因表達(dá)譜具有顯著差異，提示組織病變可能誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而引起單個核細(xì)胞表達(dá)圖譜的變化。但其變化呈現(xiàn)出漸進(jìn)的趨勢，提示衰老可能是參與AMD疾病發(fā)生發(fā)展的因素之一。
　　2.AMD患者外周血單個核細(xì)胞差異性表達(dá)基因參與的主要生物學(xué)功能包括白細(xì)胞的活化、淋巴細(xì)胞的活化、T細(xì)胞的活化以及募集等，其主要參與的信號通路包括造血細(xì)胞、T細(xì)胞受體通路、Th1 and Th2細(xì)胞分化、Th17細(xì)胞分化以及

7、原發(fā)性免疫缺陷等，這些均提示差異性表達(dá)基因可能與AMD患者的免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
　　3.AMD患者其外周血單個核細(xì)胞基因表達(dá)譜特征的變化和組織基因表達(dá)譜特征的變化并不相同，這可能與AMD的發(fā)病激發(fā)了全身免疫系統(tǒng)，在單核細(xì)胞與病變組織上均有累及，但出現(xiàn)了不同的基因表達(dá)有關(guān)。
　　第二部分 年齡相關(guān)性黃斑變性轉(zhuǎn)錄組研究
　　目的:
　　通過AMD患者與健康人轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)掘差異性表達(dá)基因?qū)MD發(fā)病和預(yù)后的影響機(jī)制，

8、為尋找新的診治靶點提供實驗依據(jù)，為AMD診斷指標(biāo)及預(yù)后指標(biāo)的研究奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　根據(jù)本研究第一部分的結(jié)果，我們首先從應(yīng)用生物信息學(xué)方法對GEO數(shù)據(jù)庫來源的AMD外周血單個核細(xì)胞樣本基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行生信分析得出的差異性表達(dá)基因(DEGs)中篩選出8個差異性表達(dá)基因(包括TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R)。然后通過實時熒光定量PCR技術(shù)(Real-

9、time qPCR)，在包含有21例中國AMD患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的實驗組與15例中國健康人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的對照組樣本中，對這些DEGs進(jìn)行驗證，得出差異性表達(dá)基因在中國AMD患者PBMC中的表達(dá)是否有差異，并進(jìn)一步將實驗組按照年齡、性別、治療效果不同進(jìn)行分組，分別進(jìn)行實驗驗證及對比研究。
　　結(jié)果:
　　1.在這8個候選差異性表達(dá)基因中，共3個基因在驗證樣本中結(jié)果與數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果相一致，TMEM17

10、6A、TMEM176B和ZEB2在AMD外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中顯著上調(diào)表達(dá)（P=0.0000，0.0000，0.0000，P＜0.001）;另外5個候選DEGs在驗證樣本中的結(jié)果與數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果并不一致，LEF1、MS4A1、CD3G、FCMR與IL7R在AMD患者PBMCs中表達(dá)顯著上調(diào)(P=0.0000，0.0000，0.0000,0.0000,0.0000, P＜0.001)。
　　2.8個候選基因在AMD組不同性別

11、病人PBMCs中的表達(dá)水平與健康正常人不同性別中的表達(dá)水平相比均存在顯著差異，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01); TMEM176A、FCMR、CD3G、MS4A1、IL7R、ZEB2與LEF1基因表達(dá)水平在女性患者中高于男性患者，但兩者之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); TMEM176B基因在男性患者中高于女性患者，兩者之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。這表明，與健康人相比較，8個候選基因表達(dá)水平在不同性別的患者外周

12、血PBMCs中均存在顯著差異，但與患者的性別無顯著相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.TMEM176A、TMEM176B、ZEB2、LEF1、FCMR、MS4A1、CD3G和IL7R在AMD患者外周血單個核細(xì)胞中存在顯著差異性表達(dá)。這些差異表達(dá)基因其功能主要涉及膜受體及相關(guān)的信號傳導(dǎo)，其編碼的蛋白主要分布在細(xì)胞膜外側(cè)，其參與的生物學(xué)過程主要涉及免疫反應(yīng)及免疫細(xì)胞的分化。這些均提示AMD的發(fā)生發(fā)展與全身免疫反應(yīng)密切相關(guān)。
　　2

13、.候選基因表達(dá)水平在不同性別的患者外周血PBMCs中與健康人比較均存在顯著差異，但與患者的性別無顯著相關(guān)。提示AMD的發(fā)生進(jìn)展無明顯性別差異。
　　第三部分 抗VEGF藥物玻璃體腔注射聯(lián)合PDT治療年齡相關(guān)性黃斑變性的療效研究
　　目的:
　　尋找更加安全有效的AMD治療方案，為新的AMD治療方案的制定提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　按照入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)選擇2013年1月-2016年1月期間在鄭州大學(xué)第一

14、附屬醫(yī)院被診斷為年齡相關(guān)性黃斑變性的96例（192只眼睛）患者。按照治療方案，患者被隨機(jī)分成觀察組和對照組，每組48例（96只眼睛）。對照組患者進(jìn)行抗VEGF藥物治療，玻璃體腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠單抗，根據(jù)3+prn治療方案，每月注射一次，連續(xù)注射3次后根據(jù)病情需要再追加注射。觀察組患者進(jìn)行抗VEGF藥物聯(lián)合PDT治療方法，PDT治療按照年齡相關(guān)性黃斑變性的多中心PDT治療研究(Treatment of age-rela

15、ted macular degeneration withphotodynamic therapy，TAP)的方法進(jìn)行，維替泊芬用量為TAP方法計算量6mg/m2，激波長689nm，光輻照度600 mw/ cm2，能量50 J/cm2，照射時間83 S。在PDT治療后3天內(nèi)行玻璃體腔注射0.5 mg/0.05 ml雷珠單抗。治療前和治療后1周-6月分別檢測最佳矯正視力、眼部血流動力學(xué)改變、黃斑中心凹厚度(CFT)及視野參數(shù)。采用SPSS

16、23.0統(tǒng)計軟件分析本研究的數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.治療后兩組患者最佳矯正視力均緩慢上升。術(shù)后1周-6個月內(nèi)，觀察組患者最佳矯正視力明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);觀察組患者視力提高的比例高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2.治療后6個月內(nèi)彩色多普勒超聲檢查顯示，觀察組患者睫狀后短動脈(PCA)的最大收縮期血流速度(PSV)和舒張末期血流速度(EDV)值高于對照組，差異有統(tǒng)計

17、學(xué)意義(P＜0.05);觀察組患者動脈阻力指數(shù)(RI)和脈動指數(shù)(PI)值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.抗VEGF藥物聯(lián)合PDT療法能夠明顯提高治療后最佳矯正視力，治療后提高視力的比率明顯增高，治療AMD效果明顯。
　　2.抗VEGF藥物聯(lián)合PDT療法能夠改善PCA血流動力學(xué)參數(shù)，血液供應(yīng)改善能減輕黃斑中心的水腫，降低中心凹厚度(CFT)值，減少視野缺損，具有較高的臨床應(yīng)用價值。<