Delphinidin預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，ARMD）是一種老年常見(jiàn)病，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率越來(lái)越高，因ARMD致盲的人數(shù)將會(huì)超過(guò)因青光眼和糖尿病性視網(wǎng)膜病變的致盲數(shù)，成為一個(gè)社會(huì)性的公共問(wèn)題。然而，現(xiàn)在臨床上對(duì)已經(jīng)發(fā)生損傷的ARMD患者治療效果并不明顯，TAP（Treatment of Age-Related Macular Degeneration with Photodynamic T

2、herapy）和VIP（visual impairment project）研究發(fā)現(xiàn)，在重度ARMD臨床治療組同未治療組相比較分別僅僅有5％、8％的病人通過(guò)治療視網(wǎng)膜下新生血管而獲得視力提高?，F(xiàn)在已經(jīng)認(rèn)識(shí)到對(duì)其研究的重點(diǎn)應(yīng)放在預(yù)防ARMD的發(fā)生和發(fā)展上，包括預(yù)防干性ARMD中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelium，RPE）的氧化損傷和濕性ARMD中新生血管的生成，而不是單純治療各種已發(fā)生的損傷。

3、 近年來(lái)，自然藥物在人類疾病的預(yù)防和治療中應(yīng)用越來(lái)越廣，其中1983-1994年研究的520種藥物中，39％是來(lái)自自然產(chǎn)品，1999年銷售量最大的20種非蛋白類藥物中，9種是由自然產(chǎn)品發(fā)展而來(lái)。在ARMD的防治上已經(jīng)有些藥物正嶄露頭角，如博視康牌葉黃素片等，但其昂貴的價(jià)格和其主要的抗氧化損傷作用，使其在應(yīng)用上有一定的局限性[4]。而delphinidin為花色素的一種主要成份，大量存在于蔬菜和水果中，已經(jīng)研究其有強(qiáng)的抗氧化、抗新生血管生

4、成、抗腫瘤生長(zhǎng)的能力[5]，其是否對(duì)RPE細(xì)胞的氧化損傷和脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞新生血管生成功能具有抑制作用目前不清楚。我們假定delphinidin對(duì)RPE細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的作用同對(duì)其他細(xì)胞一樣，既可以抗氧化損傷，又可以抑制新生血管生成，則對(duì)其的研究有望為ARMD的防治帶來(lái)新的曙光。 目的： 1、探討delphinidin對(duì)ARPE-19細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。 2、研究delphinidin對(duì)缺氧環(huán)境下AR

5、PE-19細(xì)胞和猴脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮（hesus choroids-retina endothelial cell line，RF/6A）細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響及可能機(jī)制。 3、觀察delphinidin抗RF/6A細(xì)胞體外新生血管生成的作用及機(jī)制。 方法： 1、利用MTT比色法，觀察體外培養(yǎng)條件下，delphinidin對(duì)ARPE-19細(xì)胞增殖活性的影響；Hoechst染色、JC-1、ROS試劑盒和RT-PC

6、R分別檢測(cè)細(xì)胞在H2O2氧化損傷下不同濃度delphinidin（1μM、5μM、10μM、20μM）預(yù)處理組同對(duì)照組中細(xì)胞凋亡、線粒體胞膜電位、ROS含量和bcl-2 mRNA含量的變化。 2、傳代培養(yǎng)ARPE-19、RF/6A細(xì)胞，Ⅷ因子免疫組化鑒定RF/6A細(xì)胞；MTT檢測(cè)delphinidin對(duì)RF/6A細(xì)胞毒性；delphinidin（1μM、5μM、10μM、20μM）預(yù)處理組和對(duì)照組采用western-blot法檢

7、測(cè)各組細(xì)胞在CoCl2損傷下對(duì)VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達(dá)的變化。 3、傳代培養(yǎng)RF/6A細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組及delphinidin（1μM、5μM、10μM、20μM）預(yù)處理組，采用MTT和caspase-3免疫組化法檢測(cè)各組在VEGF刺激下RF/6A細(xì)胞增殖和凋亡情況；transwell小室遷移和Matrigel膠體外血管形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移及血管形成情況；western-blot檢測(cè)各組VEGF刺激下P-

8、FAK蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果： 1.10-6M～10-1M delphinidin處理ARPE-19細(xì)胞后未發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞毒性。用1μM、5μM、10μM、20μM delphinidin分別預(yù)處理RPE細(xì)胞后進(jìn)行H2O2氧化損傷，發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的數(shù)量減少，線粒體膜電位的降低程度減少，細(xì)胞內(nèi)ROS含量減少，bcl-2 mRNA含量增加，且這些變化具有劑量依賴性，各處理組與對(duì)照組相比差異有顯著性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.

9、05）。 2.Ⅷ因子胞漿著染證明所用RF/6A細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞，10-6M～10-1M delphinidin并未顯示出對(duì)RF/6A細(xì)胞毒性。1μM、5μM、10μM、20μM delphinidin預(yù)處理RPE、RF/6A細(xì)胞組可見(jiàn)CoCl2損傷后的VEGF、HIF-1α蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，且呈劑量相關(guān)性，各處理組與對(duì)照組相比差異有顯著性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而HIF-2α蛋白的表達(dá)并未受到影響，各處

10、理組同對(duì)照組相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 3.1μM、5μM、10μM、20μM delphinidin預(yù)處理RF/6A細(xì)胞組可呈劑量依賴性抑制VEGF刺激下細(xì)胞的體外增殖、遷移和體外血管形成，同時(shí)P-FAK蛋白表達(dá)降低，各處理組與對(duì)照組相比差異有顯著性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論： 1.Delphinidin可減輕H2O2造成的ARPE-19細(xì)胞氧化損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)改善