番茄WRKY基因克隆及分析.pdf

1、植物采用多種機(jī)制對(duì)生物和非生物逆境做出適應(yīng)性反應(yīng)。在植物與環(huán)境的相互作用研究中，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注植物基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的研究已成為現(xiàn)今植物基因研究的一個(gè)重點(diǎn)。當(dāng)植物受到外界環(huán)境刺激后，其體內(nèi)會(huì)通過(guò)一系列信號(hào)傳遞，最終誘導(dǎo)植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，在此過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄因子起著極其重要的作用。在植物中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) MYB、bHLH蛋白、MADS域蛋白、WRKY鋅指蛋白、AP2域蛋白、bZIP蛋白等多種轉(zhuǎn)錄因子。在眾多的轉(zhuǎn)錄因子中，

2、WRKY轉(zhuǎn)錄因子便是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，因其在N端含有由WRKYGQK組成的高度保守的氨基酸序列而得名，在保守結(jié)構(gòu)域的下游含有一種只存在于植物轉(zhuǎn)錄因子中的特殊的鋅指基序。WRKY基因在植物體內(nèi)會(huì)受外界環(huán)境的激發(fā)而誘導(dǎo)表達(dá)，具有快速、瞬時(shí)和組織特異性表達(dá)等特點(diǎn)，并參與生物和非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)。各種高等植物當(dāng)機(jī)體受到病原物侵害時(shí)，WRKY基因就能快速且大量的表達(dá)。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物防衛(wèi)反應(yīng)、植物生長(zhǎng)發(fā)育、植物代謝以及信號(hào)轉(zhuǎn)

3、導(dǎo)中起調(diào)控作用。此外，一些 WRKY蛋白還具有自我調(diào)控的能力。目前雖然對(duì)擬南芥、煙草及水稻中的WRKY基因研究較多，但迄今為止有關(guān)番茄 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的報(bào)道卻很少。本實(shí)驗(yàn)擬在番茄中獲得和抗病相關(guān)的WRKY基因，為番茄抗病育種奠定基礎(chǔ)。
　　本研究以番茄苗為實(shí)驗(yàn)材料，根據(jù)筆者課題組已經(jīng)克隆出的番茄特異的WRKY基因片段和番茄 EST序列設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR技術(shù)從100μM JA處理的番茄苗中克隆得到 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的部

4、分 cDNA序列，再利用RACE技術(shù)克隆獲得3'cDNA序列，長(zhǎng)1028 bp，編碼187個(gè)氨基酸；5'cDNA序列，長(zhǎng)823 bp。將獲得的序列連接到 pMD19-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，篩選陽(yáng)性克隆，用雙酶切分析法對(duì)其進(jìn)行鑒定并進(jìn)一步對(duì)核酸序列進(jìn)行測(cè)序分析。將3'cDNA序列和5'cDNA序列進(jìn)行全序列拼接，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，該基因全長(zhǎng)為1740bp，最長(zhǎng)的開(kāi)放閱讀框?yàn)?083bp，編碼360個(gè)氨基

5、酸，含有一個(gè) WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域及C2H2鋅指基序，因此可初步推斷該基因?qū)儆赪RKY第ΙΙ家族成員。Blastn序列分析表明，該基因與FJ654265。1(E:0.0)、AK329773.1(E:0.0)、FJ654264.1(E:0.0)、EU755370.2(E:0.0)、AY789641.1(E:0.0)、AB028022.1(E:0.0)的相似性分別是91％、88％、85％、86％、80％、69％，這也表明所克隆的基因?qū)儆?/p>

6、WRKY基因家族。
　　利用相關(guān)軟件對(duì)所克隆的WRKY基因進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及初步的功能預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，WRKY蛋白的分子量為39.77 KD，理論等電點(diǎn)pI值為8。57。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明該蛋白中α螺旋占28。55％，β折疊占21.80％，無(wú)規(guī)卷曲占49.65％。對(duì)該蛋白進(jìn)行跨膜分析，結(jié)果表明該蛋白無(wú)跨膜螺旋區(qū)，不是膜蛋白。此外對(duì)其進(jìn)行分析未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，初步斷定其不是分泌型蛋白。
　　本實(shí)驗(yàn)利用Real-time PCR的方

7、法對(duì)番茄 WRKY基因的表達(dá)模式進(jìn)行了初步的探索，通過(guò)研究番茄 WRKY基因在不同脅迫下的表達(dá)情況，了解該基因在逆境下的表達(dá)規(guī)律，并以此來(lái)初步推斷該基因可能參與的防衛(wèi)信號(hào)途徑。結(jié)果表明，番茄 WRKY基因在JA(100μM)、SA(1mM)、NaCl(100mM)、4℃一系列非生物逆境條件下均有表達(dá)，且在JA(100μM)處理12h后表達(dá)量有明顯增高的趨勢(shì)。此外，為了研究該基因?qū)Ψ焉L(zhǎng)發(fā)育的影響，分別對(duì)根、莖、葉中WRKY基因的表達(dá)情