番茄硫氧還蛋白基因Trxf1的克隆及表達分析.pdf

1、本研究以加工番茄品種“雙豐87-5”作為試驗材料，克隆了番茄硫氧還蛋白Trxf1基因，對基因在真核和原核方面進行了表達，進一步對番茄硫氧還蛋白Trxf1基因進行實時熒光定量分析，主要內(nèi)容包括：⑴克隆了番茄Trxf1基因，對該基因編碼的蛋白序列進行了氨基酸同源性和進化樹分析，番茄Trxf1與同為茄科茄屬的馬鈴薯的同源性最高，與模式植物擬南芥的同源性最低；系統(tǒng)進化樹顯示，番茄Trxf1基因與馬鈴薯Trxf1基因的親緣關(guān)系最近，與擬南芥等十字

2、花科植物親緣關(guān)系最遠。⑵利用克隆的Trxf1基因的編碼區(qū)以及真核表達載體pBI121，成功構(gòu)建了植物表達載體 pBI121-Trxf1，采用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化番茄，提取植物DNA，經(jīng)PCR、RT-PCR分析鑒定，結(jié)果表明，植物表達載體已成功整合到番茄基因組中。⑶利用克隆的Trxf1基因的編碼區(qū)成功構(gòu)建原核表達載體pET32a-Trxf1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta(DE3)宿主菌，經(jīng)IPTG誘導，獲得相對分子量為25kD的融

3、合蛋白，通過親和層析純化可溶蛋白并獲得Trxf1融合蛋白。用抗His標簽的單抗對純化蛋白進行Western blot鑒定，證明純化的融合蛋白是帶有His標簽的Trxf1蛋白。用可溶性融合蛋白pET32a-Trxf1免疫新西蘭大白兔制備了Trxf1蛋白多克隆抗體Trxf1-KLH，ELISA測定抗體效價為1:6400，Western Blot檢測抗體特異性，證實Trxf1蛋白的多克隆抗體已制備成功。⑷利用實時熒光定量PCR對鹽脅迫下番茄硫

4、氧還蛋白基因Trxf1的時空表達分析，該基因在番茄不同組織中均有表達，且同一時期在葉片中的表達量最高；而在莖和葉器官中，鹽脅迫顯著下調(diào)了該基因的表達。外源硒對鹽脅迫下番茄Trxf1及硫氧還蛋白系統(tǒng)相關(guān)基因表達的影響研究試驗中，NaCl脅迫處理下調(diào)了加工番茄幼苗葉片F(xiàn)d/Trx系統(tǒng)各基因的mRNA轉(zhuǎn)錄表達，而施用外源硒顯著上調(diào)了NaCl脅迫處理期間加工番茄幼苗葉片各基因的mRNA轉(zhuǎn)錄表達；NaCl脅迫處理上調(diào)了加工番茄幼苗葉片NTS系統(tǒng)各