褐點石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus)三種細胞系的建立、病毒敏感性以及環(huán)境污染物對其毒性作用的研究.pdf

1、近年來，環(huán)境污染的日益加劇和各種病毒性疾病的大規(guī)模爆發(fā)，給魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。為查清魚類病毒的感染途徑和感染機理并從根本上解決魚類病毒病，魚類細胞系被廣泛應(yīng)用于病毒的分離繁殖、疫苗研制及病毒與宿主細胞的相互作用機理等研究。另外，對海洋中各種環(huán)境污染物的檢測缺乏快速靈敏有效的毒性檢測體系，利用魚類細胞系可有效地對環(huán)境污染物的毒性作用進行評價，確定環(huán)境污染物對海洋魚類產(chǎn)生影響的最低濃度并篩選出合適的生物檢測指標(biāo)，從而與理化檢測手

2、段相結(jié)合，最終建立快速靈敏有效的環(huán)境污染物毒性檢測體系。但目前已建立的魚類細胞系大多來源于淡水和江海洄游性魚類，其中多數(shù)細胞系對海水魚類病毒不敏感，而海水魚類細胞系數(shù)量不多，可用于魚類病毒的分離鑒定及體外繁殖及環(huán)境污染物的毒性研究及其檢測的海水魚類細胞系更少，遠遠不能滿足對海水魚類病毒病診斷防治和海洋中各種環(huán)境污染物檢測的需求。 褐點石斑魚(Epinephelus fuscoguttatus)隸屬于硬骨魚綱、鱸形目、鮨科、石斑魚

3、屬，是我國重要的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚種之一，同樣面臨環(huán)境污染和病毒性疾病的嚴(yán)重影響，但至今仍未有成功建立褐點石斑魚組織細胞系的相關(guān)報道。因此，迫切需要建立褐點石斑魚細胞系并應(yīng)用于魚類病毒疫苗研制和環(huán)境污染物毒性作用評價和檢測等方面，為魚類病毒學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)等研究奠定堅實的基礎(chǔ)。 為了建立褐點石斑魚細胞系，本文采用0.5％透明質(zhì)酸酶和0.2％Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化法啟動了鰭組織的原代培養(yǎng)，采用0.125％胰蛋白酶消化法啟動了心臟組織的原代培

4、養(yǎng)，不使用酶消化而僅用組織塊培養(yǎng)法啟動了鰾組織原代培養(yǎng)。將三種組織培養(yǎng)在24℃，添加有100μg/mL羧甲基殼寡糖、10ng/mL堿性成纖維樣生長因子和40ng/mLⅠ型胰島素樣生長因子的20％胎牛血清(FBS)-DMEM/F-12培養(yǎng)基(pH7.2)中，原代啟動7天后分別有細胞遷出，三種細胞均為成纖維樣細胞，生長分裂旺盛，22天內(nèi)三種細胞均長成單層，并能穩(wěn)定連續(xù)傳代。細胞生長曲線顯示，第60代的褐點石斑魚鰭、心臟和鰾細胞的群體倍增時間

5、分別為50.6 h，40.3h和43.3h。染色體數(shù)目與核型分析顯示，第60代褐點石斑魚三種細胞的特征染色體數(shù)目仍為48條，染色體數(shù)目和核型特征確定其為褐點石斑魚細胞。目前，鰭細胞已傳至第90代，心臟細胞已傳至第70代，鰾細胞已傳至第75代，已成功建立褐點石斑魚鰭、心臟和鰾三種連續(xù)性細胞系，將分別利用三種細胞系進行魚類病毒敏感性和環(huán)境污染物毒性作用評價方面的應(yīng)用研究。 為了研究褐點石斑魚心臟細胞系對魚類病毒的敏感性及其體外繁殖病

6、毒的能力，本文利用實驗室先前提取并鑒定的兩種海水魚虹彩病毒：大菱鲆紅體病虹彩病毒(TRBIV)和淋巴囊腫病毒(LCDV)，分別感染褐點石斑魚心臟細胞系細胞。兩種病毒分別加入心臟細胞中吸附2h后，于24℃，10％FBS-DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2-3天后，心臟細胞均出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)(CPE)，TRBIV感染的心臟細胞還出現(xiàn)嚴(yán)重的空泡化和顆?；F(xiàn)象。利用透射電鏡可觀察到大量典型的TRBIV或LCDV病毒粒子在心臟細胞質(zhì)中聚集并增

7、殖，病毒粒子大小和形態(tài)結(jié)構(gòu)分別與已有報道一致。CPE大于70％后收獲心臟細胞后，采用凍融1次，高速冷凍離心的方法得到利用褐點石斑魚心臟細胞系繁殖的TRBIV或LCDV病毒液。測得TRBIV和LCDV的病毒液滴度較高，分別為104.5 TCID50 ml-1叫和104.0 TCID50 ml-1，且可繼續(xù)感染其他正常心臟細胞系細胞。以上結(jié)果說明，褐點石斑魚心臟細胞系對兩種魚類虹彩病毒TRBIV和LCDV較為敏感，在目前的體外病毒繁殖條件下

8、可繁殖獲得滴度較高的兩種病毒液，褐點石斑魚心臟細胞系是TRBIV和LCDV良好的體外繁殖體系。 為了利用褐點石斑魚鰾細胞系研究久效磷對鰾細胞的毒性作用和致毒機理，并對久效磷的毒性作用進行評價以應(yīng)用于環(huán)境中有機磷農(nóng)藥污染檢測，本文使用不同濃度久效磷處理褐點石斑魚鰾細胞系細胞后，發(fā)現(xiàn)1μg/mL久效磷即可對鰾細胞產(chǎn)生細胞毒性，且呈濃度依賴性。利用MTT法和細胞蛋白含量測定法所得的久效磷對鰾細胞的48h細胞半數(shù)抑制濃度(48h-IC5

9、0)分別為30.64和31.44μg/mL。在細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)方面，久效磷處理鰾細胞72h后，細胞開始出現(xiàn)變圓脫落現(xiàn)象并隨后大量死亡。電鏡結(jié)果顯示久效磷主要引起鰾細胞線粒體的嚴(yán)重損傷。隨著久效磷濃度的增加，鰾細胞線粒體出現(xiàn)腫脹，內(nèi)嵴模糊并最終溶解等現(xiàn)象。細胞生物標(biāo)志酶活性變化結(jié)果顯示，久效磷可引起鰾細胞乙酰膽堿酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的顯著變化。根據(jù)細胞病理學(xué)及酶學(xué)方面的變化，本文推測久

10、效磷的致毒機理是引起細胞內(nèi)解毒和抗氧化防御系統(tǒng)的損傷，進而影響細胞內(nèi)線粒體的產(chǎn)能，最終導(dǎo)致細胞死亡。以上結(jié)果顯示褐點石斑魚鰾細胞系細胞對久效磷的毒性作用靈敏度高，檢測其毒性需要的時間較短，且鰾細胞的AChE、SOD和GST三種酶活性可作為久效磷的生物檢測指標(biāo)，為最終與理化檢測手段相結(jié)合，建立快速靈敏有效的有機磷污染物生物檢測體系奠定基礎(chǔ)。 為了利用褐點石斑魚鰭細胞系對三丁基氧化錫(TBTO)的毒性作用進行評價，研究TBTO對鰭細

11、胞的毒性作用和致毒機理，本文利用不同濃度的TBTO處理褐點石斑魚鰭細胞系細胞，通過MTT法和細胞蛋白含量測定法檢測了TBTO對鰭細胞的體外細胞毒性。由結(jié)果可知，1ng/mL TBTO即可對鰭細胞產(chǎn)生細胞毒性，細胞毒性隨著TBTO濃度的增加而增大，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。利用上述兩種方法所得的TBTO對鰭細胞的48h-IC50值分別為39.87和41.77ng/mL。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)TBTO處理鰭細胞120h內(nèi)細胞形態(tài)和貼壁能力與對照組相比

12、均沒有明顯可見的改變。而電鏡結(jié)果則顯示TBTO主要引起鰭細胞線粒體的嚴(yán)重損傷，線粒體出現(xiàn)腫脹，內(nèi)嵴模糊并最終溶解的現(xiàn)象，并在細胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡。鰭細胞生物標(biāo)志酶活性變化結(jié)果顯示，TBTO可引起鰭細胞SOD和GST活性的顯著變化，鰭細胞的SOD和GST酶活性可作為TBTO的生物檢測指標(biāo)，為最終與理化檢測手段相結(jié)合，建立快速靈敏有效且符合國家標(biāo)準(zhǔn)的有機錫污染物生物檢測體系奠定基礎(chǔ)。 本文旨在建立褐點石斑魚鰭、心臟和鰾細胞系，并將三種