電穿孔調節(jié)白細胞介素-1受體阻滯劑基因抑制大鼠骨性關節(jié)炎.pdf

1、目的:
　　基因治療為骨性關節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的治療提供了可能性，目前該療法開展臨床研究的瓶頸在于尋找一種安全有效的基因導入途徑，本實驗驗證作為非病毒載體的電穿孔(Electroporation，EP)對骨性關節(jié)炎的治療效果，并與研究最為廣泛的腺相關病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)載體作比較。
　　方法:
　　選用8周齡健康級雄性SD大鼠，在不同電穿孔參數下，使用電穿

2、孔將熒光素酶(Luciferase)報告基因轉染到大鼠膝關節(jié)組織內，采用小動物活體成像系統(tǒng)測定熒光強度，該強度反映在不同電穿孔參數下Luciferase基因表達水平，通過比較熒光強度以明確較佳的電穿孔參數。通過切斷右膝前交叉韌帶及切除內側半月板前腳的方法建立骨性關節(jié)炎模型，在造模術后1周，按上述所選的較佳參數值進行下一步大鼠體內治療實驗。選擇白細胞介素-1受體阻滯劑(Interleukin-1receptor antagonist，IL

3、-1Ra)作為目的基因，抑制由白細胞介素-1引起的炎癥反應。根據不同的治療方式將實驗分為五組:單純骨性關節(jié)炎未治療組（OA組，n=24）;骨性關節(jié)炎單純目的基因質粒治療組(NP組，n=24);骨性關節(jié)炎電穿孔目的基因治療組(EP組，n=24);骨性關節(jié)炎腺相關病毒轉染目的基因治療組(AAV組，n=24);正常對照組(Normal，n=24)。治療后1周開始評價，每周取材1次，共計4次。取材前使用CatWalk進行步態(tài)分析，了解由于炎癥引

4、起的患肢疼痛情況;處死大鼠抽取右膝關節(jié)液進行ELISA檢測，分析關節(jié)液中IL-1Ra、IL-1β、TNF-α蛋白含量變化;分離右膝關節(jié)股骨遠端，進行大體觀觀察，部分標本立即進行PCR檢測，了解IL-1Ra、IL-1β、TNF-α、MMP-13、ADAMTS-4基因的表達情況，部分標本進行Micro-CT掃描以了解軟骨下骨的重建情況，掃描后的樣本進行固定脫鈣、石蠟切片、病理染色，包括蘇木素-伊紅染色、番紅O染色、甲苯胺藍染色、IL-1Ra

5、及Ⅱ型膠原的免疫組織化學染色。
　　結果:
　　在電穿孔參數脈寬為30ms，質粒量為50μg時，右側膝關節(jié)表達的熒光強度明顯高于其余各組(p＜0.05)。在EP組及AAV組，由炎癥反應引起的疼痛水平明顯的低于OA組和NP組(p＜0.05)，于軟骨缺損部位選取興趣區(qū)，測得軟骨下骨骨礦化密度、骨小梁厚度升高明顯不及OA組和NP組(p＜0.05); PCR結果顯示:EP組及AAV組IL-1Ra基因表達上調明顯高于其余組(p＜0.0

6、5)，前兩周顯示，AAV組的IL-1Ra表達量明顯的高于EP組，后兩周結果相反。在OA組和NP組，IL-1β、TNF-α表達明顯上調。EP組及AAV組IL-1β、TNF-α表達高于正常對照但無統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。MMP-13和ADAMTS-4的變化趨勢類似于IL-1β和TNF-α。ELISA結果顯示出與PCR相同的變化趨勢;病理結果顯示:4周時，EP組及AAV組未見明顯軟骨破壞及細胞外基質丟失，表達IL-1Ra陽性區(qū)域分布在軟骨