蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白的C-半段對(duì)Vip3Aa7和Cry7Bal蛋白包含體形成的影響.pdf

1、本論文利用蘇云金芽胞桿菌的表達(dá)調(diào)控元件及來自Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白和晶體形成，蛋白穩(wěn)定相關(guān)的C-半段，輔助蛋白p20等研究對(duì)營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3Aa7，殺蟲晶體蛋白Cry2Aa，Cry3Aa晶體形成，表達(dá)量和殺蟲活性的影響，建立了一個(gè)蘇云金芽胞桿菌高效表達(dá)體系；并通過Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白的N-、C-半段互換，研究了蘇云金芽胞桿菌Cry1類殺蟲晶體蛋白的C-半段對(duì)Cry7Ba1晶體蛋白溶解性

2、，晶體形成及毒性的影響，主要結(jié)果如下：
　　 1．蘇云金芽胞桿菌C-半段使Vip3Aa7形成包含體并且顯著提高其表達(dá)量
　　 本文利用蘇云金芽胞桿菌ICPs蛋白的各種表達(dá)調(diào)控元件，希望提高營(yíng)養(yǎng)期殺蟲蛋白Vip3Aa7的表達(dá)量，改善其因?yàn)榉置诘桨饨o生產(chǎn)應(yīng)用帶來的不便，研究芽胞依賴型BtⅠ-BtⅡ啟動(dòng)子，上游調(diào)控區(qū)，終止子及大分子殺蟲晶體蛋白C-半段對(duì)Vip3Aa7表達(dá)量和包含體形成的影響，結(jié)果表明：
　　 1.1

3、 Cry1C的C-半段不僅顯著提高了Vip3Aa7融合蛋白的表達(dá)量，重組蛋白的表達(dá)量比出發(fā)菌株的表達(dá)量高9.3倍，而且使其形成包含體。
　　 1.2 Cry1Ac和Cry7Ba1蛋白的C-半段與Cry1C的的C-半段具有同樣的功能，均能顯著提高Vip3Aa7融合蛋白的表達(dá)量，重組蛋白的表達(dá)量比出發(fā)菌株的表達(dá)量分別高9.4．和9.0倍，而且也能使其形成包含體。
　　 1.3生物測(cè)定結(jié)果表明，重組蛋白的殺蟲毒力與出發(fā)菌株的蛋

4、白相比普遍降低了。
　　 本實(shí)驗(yàn)首次報(bào)道Cry1C晶體蛋白的C-半段能使Vip3Aa7蛋白以包含體的形式存在，并且顯著提高其表達(dá)量，這為Vip3Aa7蛋白以芽胞制劑的形式在生產(chǎn)中應(yīng)用奠定了相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，具有非常重要的理論實(shí)踐意義。
　　 2．輔助蛋白p20提高Vip3Aa7融合蛋白表達(dá)的表達(dá)量
　　 將來自以色列亞種的輔助蛋白p20構(gòu)建到另一穿梭載體pBE2上，與上文構(gòu)建的重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)構(gòu)建了一系列工程菌，發(fā)現(xiàn)輔

5、助蛋白p20對(duì)以上Vip3Aa7融合蛋白表達(dá)量均有提高，幾個(gè)融合蛋白在晶體形成上沒有明顯不同，而且p20并不影響融合蛋白的殺蟲活性。說明輔助蛋白p20能提高Vip3Aa7融合蛋白的表達(dá)量。
　　 3．Cry1類蛋白的C-半段顯著提高Cry2Aa和Cry3Aa蛋白的表達(dá)量
　　 將Cry1C和Cry1Ac的C-半段分別與Cry2Aa和Cry3Aa的毒力核心區(qū)融合在一起，構(gòu)建融合基因，結(jié)果表明Cry1C和Cry1Ac的C-半

6、段使不含C-半段的Cry2Aa和Cry3Aa的蛋白表達(dá)量顯著提高，但仍然不能使Cry2Aa和Cry3Aa形成規(guī)則晶體，只能形成無規(guī)則形狀的包含體，重組蛋白殺蟲毒力與出發(fā)蛋白相比沒有顯著變化，說明本文建立的超量表達(dá)系統(tǒng)不含C-半段的蘇云金芽胞桿菌的表達(dá)量也能顯著，并且不影響重組蛋白的功能和活性。
　　 4．Cry1類蛋白的C-半段提高了Cry7Ba1蛋白的溶解性并且恢復(fù)了其毒力
　　 Cry7Ba1殺蟲晶體蛋白只有在pH>

7、11.5的堿性溶液中才能溶解，并且晶體蛋白只有在體外溶解后才對(duì)小菜蛾表現(xiàn)出一定毒性，這極大影響了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)將Cry1C、Cry1Ac和Cry7Ba1的N-、C-半段互換，研究較易溶解的蘇云金芽胞桿菌Cry1類的C-半段對(duì)Cry7Ba1蛋白溶解性的影響。結(jié)果表明：Cry7Ba1的難溶性是由其C-半段決定，其毒性由N-半段決定。通過替換C-半段提高了Cry7Ba1晶體蛋白的溶解性從而恢復(fù)了其毒力，為解決這一類由于溶解性的喪