蘇云金芽胞桿菌殺線蟲蛋白基因cry6Aa的表達(dá)負(fù)調(diào)控及殺線蟲晶體蛋白進(jìn)入根結(jié)線蟲體內(nèi)的模式.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis)是一種在土壤中廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌，在芽胞形成期產(chǎn)生的晶體蛋白對(duì)許多昆蟲有毒力，因而被廣泛用作害蟲的生物防治。近些年來發(fā)現(xiàn)其對(duì)線蟲也有毒力。本文從蘇云金芽胞桿菌對(duì)植物寄生線蟲的防治效果、殺線蟲晶體蛋白基因表達(dá)調(diào)控和晶體蛋白對(duì)植物寄生線蟲的作用方式等方面研究了蘇云金芽胞桿菌對(duì)植物寄生線蟲的作用。 1.測定了蘇云金芽胞桿菌YBT-1532菌株對(duì)根結(jié)線蟲毒力及防治效果。該

2、菌株攜帶有編碼130kDa晶體蛋白的殺線蟲基因cry1Ea6，同時(shí)該菌株還產(chǎn)生豐富的蘇云金素，也對(duì)線蟲有很高的毒力。分別測定該菌株產(chǎn)生的晶體蛋白和蘇云金素對(duì)北方根結(jié)線蟲(Meloidogynehapla)二期幼蟲的毒力，發(fā)現(xiàn)它們都表現(xiàn)出了很高的毒力，其LC50分別為19.32μg/mL和25.87μg/mL。同時(shí)，我們還測定了在盆栽條件下該菌株對(duì)北方根結(jié)線蟲的防治效果。結(jié)果顯示，在盆栽條件下該菌株可以有效抑制北方根結(jié)線蟲對(duì)番茄的感染、降

3、低根組織上根結(jié)數(shù)量、產(chǎn)卵量以及土壤中的蟲口密度。我們還進(jìn)行了防治花生根結(jié)線蟲(M.arenria)的田間初步實(shí)驗(yàn)，該菌株對(duì)花生根結(jié)線蟲并沒有表現(xiàn)出明顯的防治效果，但是可以使花生增產(chǎn)6％左右。 2.在殺線蟲晶體蛋白基因cry6Aa2操縱子中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)負(fù)調(diào)控因子。在cry6Aa2基因下游還有一個(gè)基因orf2，兩基因之間存在一個(gè)莖環(huán)。處在兩基因之間的莖環(huán)抑制orf2的表達(dá)，使之處于一個(gè)相對(duì)較低的表達(dá)水平。當(dāng)突變orf2時(shí)，cry6Aa

4、2基因表達(dá)量明顯提高；當(dāng)在出發(fā)菌株YBT-1518中突變orf2基因時(shí)，cry6Aa2的表達(dá)水平也顯著提高；當(dāng)去掉莖環(huán)結(jié)構(gòu)時(shí)，orf2得到大量表達(dá)，cry6Aa2表達(dá)水平急劇降低，這預(yù)示著orf2對(duì)cry6Aa2基因的表達(dá)有負(fù)向調(diào)控作用。同時(shí)EMSA實(shí)驗(yàn)還表明orf2表達(dá)的蛋白質(zhì)能結(jié)合到莖環(huán)上。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在克隆的操縱子當(dāng)中，莖環(huán)抑制調(diào)節(jié)基因orf2的表達(dá)，而調(diào)節(jié)基因orf2表達(dá)的蛋白質(zhì)結(jié)合到莖環(huán)上，這可能打開莖環(huán)，從而影響了cr

5、y6Aa2基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的穩(wěn)定性，因而降低了cry6Aa2的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)cry6Aa2表達(dá)的負(fù)向調(diào)控。在蘇云金芽胞桿菌中，存在著許多正向調(diào)節(jié)因子來提高殺蟲晶體蛋白基因的表達(dá)，而像本研究中orf2這種負(fù)向調(diào)節(jié)因子還比較少見。本研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的晶體蛋白基因表達(dá)負(fù)向調(diào)控模式，為提高晶體蛋白表達(dá)量提供了一條新的途徑。 3.初步研究了晶體蛋白進(jìn)入根結(jié)線蟲體內(nèi)的方式。由于植物寄生線蟲大多專性寄生，主要依靠其刺吸式口器-口針從植物

6、細(xì)胞內(nèi)吸取細(xì)胞內(nèi)含物的方式來取食，晶體蛋白很難通過其口針直接進(jìn)入體內(nèi)。但是許多研究結(jié)果表明，伴胞晶體蛋白的確能夠?qū)χ参锛纳€蟲表現(xiàn)出毒力，那么，蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白是如何進(jìn)入植物寄生線蟲體內(nèi)并且發(fā)生毒力作用的呢?本文以北方根結(jié)線蟲為作用對(duì)象，Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)溶解的晶體蛋白毒素Cry6Aa2的確可以通過某種方式進(jìn)入根結(jié)線蟲體內(nèi)，并且與線蟲體內(nèi)的毒素受體結(jié)合，使得毒素分子量明顯增加；而用CrySB毒素感染根結(jié)線蟲，從線蟲體內(nèi)

7、也能檢測到該蛋白，但是發(fā)現(xiàn)該蛋白被降解成大約70kDa，這也表明兩種典型的殺線蟲晶體蛋白Cry6A和Cry5B對(duì)線蟲的作用方式有差異。用對(duì)線蟲無毒力的小分子量蛋白Cry51Aa1作用根結(jié)線蟲時(shí)，同樣能從其體內(nèi)檢測到該蛋白，但是分子量沒有任何變化。用羅丹明標(biāo)記的Cry6Aa2毒素作用根結(jié)線蟲，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，熒光信號(hào)首先出現(xiàn)在線蟲體表，隨著作用時(shí)間的延長，線蟲體內(nèi)才開始出現(xiàn)熒光，而且熒光信號(hào)從最初的彌散狀態(tài)逐漸集中到其腸道組