GPER蛋白介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌中IL-6-STAT3信號(hào)通路的激活.pdf

1、目的：子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生于子宮內(nèi)的一種上皮性惡性腫瘤，為女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。根據(jù)臨床及病理觀察結(jié)果將子宮內(nèi)膜癌分為：Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型為雌激素依賴型癌，最常見的病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌，這種類型大多數(shù)伴有前期子宮內(nèi)膜增生和(或)子宮內(nèi)膜上皮內(nèi)瘤變，在持續(xù)單一雌激素刺激下產(chǎn)生。Ⅱ型為非激素依賴型癌，與臨床雌激素刺激無(wú)關(guān)，主要源自萎縮或靜止的子宮內(nèi)膜，最常見的病理類型包括漿液性乳頭狀腺癌、透明細(xì)胞癌和癌肉瘤。Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞異

2、型性大，進(jìn)展快，易出現(xiàn)深肌層浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。關(guān)于Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的信號(hào)傳導(dǎo)通路是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，雌激素如何導(dǎo)致Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生尚需深入研究。
　　G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G-protein coupled estrogen receptor, GPER)是一種膜結(jié)合的雌激素結(jié)合蛋白，其作用方式與經(jīng)典的雌激素受體不同，主要通過(guò)介導(dǎo)雌激素作用活化其下游的快速非基因組信號(hào)通路(non-genomic signaling)，其中包括MA

3、PK/ERK、PI3K/AKT、cAMP、鈣離子流動(dòng)等發(fā)揮細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲、血管形成等惡性生物學(xué)效應(yīng)。由于能夠與雌激素及其相關(guān)化合物結(jié)合介導(dǎo)快速非基因組效應(yīng),廣泛參與調(diào)節(jié)身體各項(xiàng)生理活動(dòng)，其結(jié)構(gòu)、定位、相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及與雌激素相關(guān)疾病的關(guān)系引起了研究者們的廣泛關(guān)注。
　　炎癥微環(huán)境是腫瘤的重要特征之一，IL-6(interleukin-6)最早是由Muraguch等命名為T細(xì)胞替代因子，既可由淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞、B細(xì)胞)分

4、泌,也可由非淋巴細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)分泌。許多抗原和非抗原性物質(zhì)也可誘導(dǎo)、刺激IL-6的分泌,如細(xì)菌內(nèi)毒素、一些中藥單體和細(xì)胞因子等。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducers and activators of transcription3,STAT3)是一類雙功能分子，既可以傳導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)，又可以激活基因轉(zhuǎn)錄。IL-6激活其下游的STAT3，誘導(dǎo)和維持腫瘤的炎癥微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，Ⅰ、

5、Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌患者血清中的IL-6均處于高水平，Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌高于Ⅰ型，提示IL-6/STAT3通路可能在Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。有研究證明了雌激素能夠通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，故研究者推測(cè)，子宮內(nèi)膜癌中可能存在GPER蛋白對(duì)IL-6/STAT3炎癥信號(hào)通路的調(diào)控作用。
　　本研究選用雌激素受體陽(yáng)性表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞、雌激素受體低表達(dá)的HEC-1A細(xì)胞、雌激素受體陰性的

6、KLE細(xì)胞為研究對(duì)象，在體外試驗(yàn)中用17-β雌二醇(E2)、GPER特異性激動(dòng)劑(G1)、GPER特異性拮抗劑(G15)處理細(xì)胞，檢測(cè)其細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6含量及GPER、P-ERK、P-STAT3的蛋白表達(dá)水平，從而探討GPER蛋白對(duì)IL-6/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控及該調(diào)控通路在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的作用及可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1細(xì)胞培育：人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa，以含有10％新生牛血清的1640培養(yǎng)基

7、培養(yǎng)；HEC-1A、KLE細(xì)胞株，以含有10%新生牛血清的McCoys5A培養(yǎng)基培養(yǎng)。兩種培養(yǎng)基中各加濃度為100U/ml的青霉素及鏈霉素的雙抗，培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。以0.25%胰蛋白酶消化傳代，細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)。
　　2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-6的分泌量。待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%后，更換無(wú)牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，分別用E2、G1及G15處理Ishikawa、HEC-1A、KLE三種

8、細(xì)胞24h，調(diào)整終濃度達(dá)10-6mol/L，各組DMSO量至一致，最后得到對(duì)照組、E2處理組、G1處理組、E2+G15處理組、G1+G15處理組。收集細(xì)胞上清液，保存于-80℃冰箱，按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)樣本。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　3 Western Blot方法檢測(cè)17-β雌二醇(E2)、GPER特異性激動(dòng)劑(G1)、GPER特異性拮抗劑(G15)作用下的三種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中 GPER、P-ERK、P-STAT3的蛋白表

9、達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1 E2及GPER特異性激動(dòng)劑G1通過(guò)活化膜性雌激素受體GPER促進(jìn)Ishikawa、HEC-1A、KLE細(xì)胞表達(dá)IL-6。
　　ELISA法檢測(cè)E2及G1對(duì)三種細(xì)胞上清液中IL-6的促分泌作用。結(jié)果顯示，藥物處理24h后，Ishikawa細(xì)胞中，E2及G1均促進(jìn)了細(xì)胞上清中IL-6的分泌量，其中E2作用較G1顯著（P<0.05）。HEC-1A及KLE細(xì)胞中，E2及G1均促進(jìn)了細(xì)胞上清中IL-6的

10、分泌量，其中G1作用較E2顯著（P<0.05）。
　　以上結(jié)果說(shuō)明E2及G1通過(guò)活化GPER蛋白促進(jìn)了三種細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。
　　2 GPER特異性拮抗劑G15對(duì)子Ishikawa、HEC-1A、KLE細(xì)胞中IL-6的抑制作用。
　　ELISA結(jié)果顯示E2+G15組、G1+G15組中E2和G1對(duì)細(xì)胞上清中IL-6的促進(jìn)作用被顯著抑制(P＜0.05)，其中HEC-1A及KLE細(xì)胞抑制作用明顯。提示，HEC-1A及KL

11、E細(xì)胞中，E2和G1對(duì)細(xì)胞上清中IL-6的誘導(dǎo)作用主要通過(guò)GPER發(fā)揮作用。
　　3 Western Blot方法檢測(cè)E2及G1對(duì)三種細(xì)胞中GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白的影響。
　　GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白在三種細(xì)胞中均有表達(dá)。且在KLE細(xì)胞中表達(dá)量最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用濃度為10-6mol/L的E2及G1作用于三種細(xì)胞0min、15min、30min、45min、1h、2h，結(jié)果顯示：Ish

12、ikawa細(xì)胞中，E2促進(jìn)了GPER、P-ERK、P-STAT3三種蛋白的表達(dá)，15min時(shí)開始升高，30min時(shí)達(dá)最高(P<0.05)。G1僅對(duì)GPER蛋白表達(dá)量有上調(diào)作用，對(duì)P-ERK、P-STAT3蛋白上調(diào)作用不明顯，說(shuō)明在Ishikawa細(xì)胞中,E2主要通過(guò)ER介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮作用，而GPER不起主要作用。HEC-1A及KLE細(xì)胞中，E2及G1對(duì)GPER、P-ERK、P-STAT3三種蛋白表達(dá)量均有上調(diào)作用，15min時(shí)達(dá)

13、最高，其中G1作用顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4 Western Blot方法檢測(cè)GPER特異性拮抗劑G15對(duì)E2及G1作用下的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中GPER、P-ERK、P-STAT3蛋白表達(dá)的影響。
　　用E2+G15、G1+G15分別處理Ishikawa細(xì)胞30min、處理HEC-1A及KLE細(xì)胞15min。結(jié)果顯示：G15對(duì)E2及G1作用下的HEC-1A、KLE細(xì)胞中三種蛋白的上調(diào)作用的抑制尤為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

14、而對(duì)Ishikawa細(xì)胞中GPER蛋白表達(dá)有下調(diào)作用，對(duì)P-ERK、P-STAT3蛋白的表達(dá)無(wú)明顯下調(diào)作用(P>0.05)。提示，在HEC-1A、KLE細(xì)胞中，GPER、P-ERK、P-STAT3在一條信號(hào)通路上。
　　結(jié)論：
　　1 E2及G1通過(guò)活化膜性雌激素受體GPER促進(jìn)細(xì)胞中IL-6的表達(dá)，且在HEC-1A及KLE細(xì)胞中，即Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中作用明顯。
　　2雌激素通過(guò)活化膜性雌激素受體GPER介導(dǎo)了子宮內(nèi)