GPR30調控子宮內膜癌IL-6-STAT3機制的研究.pdf

1、子宮內膜癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一，雌激素是其重要的致癌因子。但迄今為止，子宮內膜癌發(fā)生進展機制仍知之甚少。GPR30是一種新型雌激素跨膜受體，發(fā)揮雌激素的非基因組效應，其參與子宮內膜癌的惡性生物學行為的調控。課題組前期研究證實，雌激素與GPR30結合后，促進子宮內膜癌的增殖、侵襲和腫瘤形成，并且促進炎性因子IL-6的分泌,提示GPR30通過調控IL-6炎癥信號通路而非經由ERα的途徑促進內膜癌的播散和轉移[1，2]。炎癥微環(huán)境

2、是腫瘤的重要特征，炎性因子IL-6激活其下游的轉錄因子STAT3，誘導和維持腫瘤的炎癥微環(huán)境，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明，子宮內膜癌患者血清中IL-6均處于高水平，提示炎性因子IL-6參與子宮內膜癌的調控，子宮內膜癌與IL-6密切相關，而且雌激素又能激活STAT3。為此本研究的目的是探討新型雌激素跨膜受體GPR30對子宮內膜癌中 IL-6/STAT3炎癥信號通路的調節(jié)作用。因此本研究檢測了子宮內膜癌組織中GPR30、IL-6/STAT

3、3在的表達情況，GPR30干擾前后的子宮內膜癌細胞系 Ishikawa(ER+)，KLE(ER-)中IL-6/STAT3蛋白表達，以及細胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量，穩(wěn)定轉染下調GPR30后子宮內膜癌細胞增殖侵襲能力，以揭示GPR30對IL-6/STAT3調控及該調控通路在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展的作用及可能的機制。
　　目的：探討新型雌激素跨膜受體GPR30對子宮內膜癌中IL-6/STAT3炎癥信號通路的調節(jié)作用。
　　方法：

4、r>　　1.實驗對象：
　　1.1組織標本：隨機選取2004年5月至2012年7月在上海市第一人民醫(yī)院婦科收治的子宮內膜癌病人的手術切除標本30例。入選標準：患者年齡為37-73歲，手術前未行放化療或激素類藥物治療，并按國際婦產科聯盟（FIGO）分期標準進行分期。該研究獲得上海市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準通過，對患者履行知情同意手續(xù)。
　　1.2細胞株：本研究選用人子宮內膜癌細胞系Ishikawa和KLE由上海市第一人民醫(yī)院

5、婦產科豐有吉教授課題組保存，其中Ishikawa細胞為雌激素核受體（ER）表達陽性的細胞株，而KLE細胞是雌激素核受體（ER）表達陰性的細胞株。
　　2.采用免疫組織化學染色法檢測子宮內膜癌組織中GPR30,STAT3,IL-6R的表達情況。
　　3.實驗分組：將子宮內膜癌細胞系Ishikawa(ER+)和KLE(ER-)分為5組：①Con組：陰性對照組；②E2組：以10-8M工作濃度的雌激素處理的細胞組；③G1組:以10-

6、8M工作濃度的G1（GPR30特異性激動劑）處理的細胞組；④E2+G15組：以10-8M工作濃度的G15（GPR30特異性抑制劑）處理的E2組；⑤G1+G15組：以10-8M工作濃度的G15處理的G1組。
　　4.采用Western blot法檢測各組細胞中STAT3和IL-6R蛋白表達情況。
　　5.采用ELISA法檢測各組細胞上清液中IL-6的分泌情況。
　　6.構建GPR30沉默表達的重組質粒，并分別穩(wěn)定轉染至K

7、LE和Ishikawa細胞系,應用Western-blot方法檢測GPR30蛋白的表達情況。
　　7.實驗分組：分別給予10-8M雌激素和10-8M G1處理，分為6組：①Con組：轉染空載體的陰性對照組；②RNAi組：穩(wěn)定轉染 GPR30沉默表達的細胞；③E2+Con組：以E2處理的Con組④E2+RNAi組：以E2處理的RNAi組⑤G1+Con組：以G1處理的Con組⑥G1+RNAi組：以G1處理的RNAi組
　　8.采

8、用Western blot法測定細胞中STAT3及IL-6R蛋白表達。
　　9.采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6的含量。
　　10.采用MTT法檢測各組細胞的增殖情況。
　　11.采用Transwell法檢測各組細胞的侵襲能力。
　　結果：1. GPR30、STAT3、IL-6R均表達于子宮內膜癌組織。
　　2. E2和G1顯著上調了Ishikawa和KLE細胞中STAT3以及IL-6R蛋白表達水

9、平(P<0.05)，與對照組相比明顯上升；聯合應用G15后，STAT3和IL-6R蛋白表達的上調被阻斷(P<0.05)；
　　3.給予 E2和 G1作用后，Ishikawa和 KLE細胞中的 IL-6的分泌明顯增高（P<0.05）,而在分別聯合G15作用后，IL-6的分泌受到抑制(P<0.05)。
　　4.通過穩(wěn)定轉染下調GPR30基因后，細胞中的GPR30蛋白表達水平較轉染了無效質粒的細胞明顯下降(P<0.05)；

10、　　5. GPR30穩(wěn)定下調后，E2和G1對STAT3以及IL-6R蛋白表達的上調被阻斷(P<0.05)。
　　6. GPR30穩(wěn)定下調后，E2和G1對IL-6分泌的促進亦被抑制(P<0.05)。
　　7. GPR30穩(wěn)定下調減弱了細胞的增殖能力，抑制了E2和G1對細胞的增殖能力的促進。
　　8. GPR30穩(wěn)定下調減弱了細胞的侵襲能力，抑制了E2和G1對細胞的侵襲能力的促進。
　　結論：IL-6/STAT3炎癥