IL-6-STAT3炎性信號(hào)通路通過SATB1調(diào)控乳腺癌干細(xì)胞-癌非干細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡的體外研究.pdf

1、目的：
　　探討IL-6/STAT3炎性信號(hào)通路(Interleukin-6/Signaltransducerandactivatoroftranscription3inflammatorysignallingpathway)調(diào)控SATB1(specialATrichsequencebindingprotein)表達(dá)及對(duì)乳腺癌干細(xì)胞(breastcancerstemcell)自我更新能力的影響。
　　方法：
　?。?）

2、將MCF-7細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、傳代。通過轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證STAT3的慢病毒表達(dá)載體及STAT3的RNAi慢病毒表達(dá)載體（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供）轉(zhuǎn)染效率，并篩選出對(duì)STAT3干擾效率最高的慢病毒載體。
　?。?）應(yīng)用STAT3的慢病毒表達(dá)載體及STAT3的RNAi慢病毒表達(dá)載體并分別轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、2個(gè)空包病毒組對(duì)照組。
　?。?）采用無血清懸浮培養(yǎng)并添加IL-6的方法誘導(dǎo)建立乳腺癌干細(xì)胞的

3、體外模型，檢測(cè)同等數(shù)量的MCF-7細(xì)胞（空白組）、MCF-7/STAT3干擾組（26100）、MCF-7/空包病毒組對(duì)照組（CON077及CON235）和MCF-7/STAT3過表達(dá)組（14233）細(xì)胞中形成乳腺癌干細(xì)胞的微球體的數(shù)量和直徑大?。ǚ从臣?xì)胞中乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量多少和自我更新能力的強(qiáng)弱）。
　?。?）收集上述5組微球體重新消化成單細(xì)胞懸液，采用CCK-8方法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞（空白組）、MCF-7/STAT3干擾組（26

4、100）、MCF-7/空包病毒組對(duì)照組（CON077及CON235）和MCF-7/STAT3過表達(dá)組（14233）細(xì)胞的增殖活力。
　?。?）采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)上述5組微球體中STAT3mRNA及SATB1mRNA表達(dá)水平，Westernblot檢測(cè)STAT3，pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)水平。
　?。?）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)5組微球體中CD44+CD24－癌干細(xì)胞所占比例。
　　結(jié)果：
　?。?）M

5、CF-7細(xì)胞基本呈多邊形，梭形、成片貼壁生長(zhǎng)。通過轉(zhuǎn)染預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)MCF-7細(xì)胞的STAT3干擾效率最高的質(zhì)粒是26100：相對(duì)于對(duì)照組CON077，18940、18942和26100組的STAT3表達(dá)均有下降，分別下調(diào)了28％、38%和66%，但是26100的抑制效率最好，具有顯著性差異（P<0.05，n=3）。分組采用STAT3干擾載體26100用于干擾組。
　?。?）細(xì)胞成球能力檢測(cè)結(jié)果：5組細(xì)胞采用無血清懸浮培養(yǎng)并添加I

6、L-6連續(xù)誘導(dǎo)7d后，形成富集了乳腺癌干細(xì)胞的乳腺微球體，其中14233組細(xì)胞形成的微球體直徑顯著較大，數(shù)量顯著增多，26100組細(xì)胞形成的微球體直徑顯著減小，數(shù)量顯著減少，其余三組居中。
　?。?）CCK8細(xì)胞增殖活力檢測(cè)結(jié)果：與MCF-7組比較，MCF-7/STAT3過表達(dá)組（14233）微球體細(xì)胞增殖活力升高（P﹤0.01），MCF-7/STAT3干擾組（26100）微球體細(xì)胞增殖活力下降（P﹤0.01），MCF-7組與兩陰

7、性病毒對(duì)照組之間微球體細(xì)胞增殖活力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　?。?）IL-6/STAT3炎性信號(hào)通路關(guān)鍵組件及SATB1基因檢測(cè)結(jié)果：QRT-PCR檢測(cè)示：14233組與對(duì)應(yīng)的空包病毒組CON235比較，其STAT3mRNA與SATB1mRNA均表達(dá)上調(diào)（P﹤0.01）；26100組與對(duì)應(yīng)的空包病毒組CON077比較，其STAT3mRNA與SATB1mRNA均表達(dá)下調(diào)（P﹤0.01）；與MCF-7組比較，CON077及CO

8、N235組的STAT3mRNA及SATB1mRNA的表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，（P﹥0.05）。Westernblot檢測(cè)示：14233組STAT3，pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)高于空白對(duì)照組MCF-7、空包病毒組（CON077，CON235）和干擾組26100（P<0.05），且空白對(duì)照組MCF-7、空包病毒組（CON077，CON235）組STAT3，pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)高于干擾組26100（P<0.05）；陰性病毒對(duì)照

9、組（CON077，CON235）組與空白對(duì)照組MCF-7比較：STAT3，pSTAT3及SATB1蛋白表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P﹥0.05）。
　　（5）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果：5組微球體中14233組CD44+CD24－癌干細(xì)胞比例最高：56.43±2.85%；26100組最低：3.32±0.77%；其余三組居中分別為MCF-7組：12.41±1.53%；CON077組：13.33±2.01%；CON235組：13.58±2.35%，

10、14233組與MCF-7組，CON235組，CON077組及26100組比較其CD44+CD24－癌干細(xì)胞比例升高，P<0.05；26100組與MCF-7組，CON235組及CON077組比較其CD44+CD24－癌干細(xì)胞比例降低，P<0.05；MCF-7組，CON235組及CON077組之間CD44+CD24－癌干細(xì)胞比例變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P﹥0.05。
　　結(jié)論：
　?。?）IL-6/STAT3通路激活可以誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)