纖維素酶產(chǎn)生菌的分離鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及發(fā)酵條件與酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、從四川臥龍中國(guó)保護(hù)大熊貓研究中心提供的野外放歸大熊貓“祥祥”的12份糞樣中進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌的分離，通過(guò)剛果紅染色法分離到51株能在“羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)-剛果紅”平板上產(chǎn)生水解圈的菌株。挑選8株水解圈較大的菌株點(diǎn)種于“纖維素粉－剛果紅”平板進(jìn)行初篩，從中篩選出4株能在平板上產(chǎn)生水解圈的菌株，進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酶復(fù)篩。最后得到一株傳代性質(zhì)穩(wěn)定、高酶活的菌株，經(jīng)初步鑒定為沙雷氏菌(Serratia)命名為Serratia JF-1

2、16。 沙雷氏菌Serratia JF-1116革蘭氏染色反應(yīng)為陰性，無(wú)芽孢，菌體成直桿狀，大小為0.5～08.μm×0.9～2.0μm，菌體兩端為圓形，兼性厭氧，有運(yùn)動(dòng)性。菌落白色濕潤(rùn)，生長(zhǎng)溫度范圍為20～37℃，最適生長(zhǎng)溫度為28℃。該菌株可利用葡萄糖產(chǎn)酸，也能利用木糖、阿拉伯糖、甘露醇等產(chǎn)酸。過(guò)氧化氫酶呈陽(yáng)性，利用檸檬酸鹽和丙酸鹽，可分解明膠。硝酸鹽還原陽(yáng)性，M.R陰性、V.P陽(yáng)性，V.P培養(yǎng)物pH為5.4～6.5。

3、 用PCR技術(shù)擴(kuò)增了沙雷氏菌Serratia JF-1116的16S rDNA全序列，并對(duì)其進(jìn)行了克隆和測(cè)序，對(duì)該序列在GenBank中的BLAST結(jié)果表明，所有與該序列高度同源的序列都為腸桿菌科(Emerobacteriaceae)的16S rDNA基因序列，其中相似性最高的為serratia屬的菌株。該序列與serratia屬的幾個(gè)模式菌S.grimesii,S.proteamaculans，S.liquefaciens，S.fo

4、nticola的相似性分別為99.8％，99.4％，98.5％和97.5％。在此基礎(chǔ)上以一株芽孢桿菌(Bacillus subtilis)16SrDNA序列為外種群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。用CLUSTAL W1.8進(jìn)行多序列比對(duì)，采用PHYLIP軟件包構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。菌株JF-1116與3株Serratia聚類在一起，其中菌株JF-1116和S.grimesii親緣最近，其分支置信度為90％，結(jié)合分子進(jìn)化樹(shù)和生理生化鑒定的結(jié)果，將JF-1116

5、命名為格氏沙雷氏菌(S.grimesii)。菌株JF-1116進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酶試驗(yàn)結(jié)果表明，以羧甲基纖維素鈉0.5％為碳源，蛋白胨1％為氮源，麩皮3％為添加物，在28℃，20％裝液量,搖床振蕩培養(yǎng)24h后，其發(fā)酵液濾紙酶活(FPA)可高達(dá)111.5u/mL。通過(guò)對(duì)其粗酶液的性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，該菌所產(chǎn)纖維素酶粗酶液中的FPA、CMCase和β-葡萄糖苷酶的最適產(chǎn)酶溫度分別為50℃、50℃、55℃。其中CMCase在pH4.2～5.4范圍內(nèi)酶活較高