自體軟骨微粒復(fù)合仿生凝膠修復(fù)局灶性關(guān)節(jié)軟骨缺損研究.pdf

1、軟骨是分布在長(zhǎng)骨的兩端，其生理作用是承重、耐磨、低摩擦界面，使關(guān)節(jié)在運(yùn)動(dòng)時(shí)不會(huì)產(chǎn)生疼痛。但是軟骨沒有血管、神經(jīng)、淋巴組織和低細(xì)胞分布密度，這導(dǎo)致軟骨在受到損傷時(shí)很難修復(fù)或者修復(fù)成僵硬的纖維軟骨，容易導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎，造成患者的疼痛或者關(guān)節(jié)的殘疾，給患者造成嚴(yán)重的精神和身體不適。關(guān)節(jié)軟骨在臨床上十分常見，許多創(chuàng)傷造成直接的軟骨損傷如關(guān)節(jié)內(nèi)骨折、或者間接的造成軟骨損傷如關(guān)節(jié)周圍的韌帶損傷后造成軟骨損傷;許多病理?xiàng)l件能造成軟骨損傷如骨性關(guān)節(jié)炎、

2、肢端肥大、血友病、內(nèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。
　　研究目的:軟骨組織工程是將種子細(xì)胞（干細(xì)胞或者軟骨細(xì)胞）和細(xì)胞因了接種在各種不同的生物支架上用來修復(fù)軟骨缺損，利用細(xì)胞分泌的胞外基質(zhì)逐漸替代支架，與周圍正常軟骨整合，達(dá)到修復(fù)軟骨的目的。組織工程技術(shù)為基礎(chǔ)的軟骨細(xì)胞移植方法經(jīng)歷了三個(gè)發(fā)展階段:第一代ACI技術(shù):1984年P(guān)eterson報(bào)道在兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，用可吸收縫線將自體骨膜作為覆蓋膜縫于軟骨缺損周緣，將體外擴(kuò)增的自體軟骨細(xì)胞懸液注

3、入缺損，術(shù)后16周修復(fù)組織為透明樣軟骨;第二代ACI技術(shù):2006年Gooding等報(bào)道用Ⅰ/Ⅲ型膠原薄膜代替骨膜進(jìn)行對(duì)照研究，術(shù)后2年隨訪證實(shí)修復(fù)效果與骨膜組比無差異，其優(yōu)點(diǎn)避免了因獲取骨膜而增加額外創(chuàng)傷，但可能存在細(xì)胞外漏、覆蓋膜脫落等問題。為了克服ACI技術(shù)缺點(diǎn)，研究者將擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞種植在Ⅰ/Ⅲ膠原支架上，共培養(yǎng)后用生物膠固定于缺損，此技術(shù)為第三代ACI技術(shù)，即基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植(MACI)。然而這些方法在修復(fù)軟骨缺損上

4、的療效并不是十分理想，原因在于:（一）體外擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞增殖能力有限，且易發(fā)生細(xì)胞表型改變。ACI技術(shù)和MACI技術(shù)均需對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，由于體外難以模擬在體微環(huán)境，尤其是缺乏機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞容易發(fā)生去分化。表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，透明軟骨基質(zhì)的主要成分Ⅱ型膠原蛋白基因表達(dá)減少，而纖維軟骨的主要成分Ⅰ型膠原纖維基因表達(dá)增加。軟骨細(xì)胞表型的改變必將影響其體內(nèi)分泌基質(zhì)的功能，從而導(dǎo)致再生軟骨質(zhì)量缺陷。（二）植

5、入的支架材料與天然軟骨基質(zhì)存在較大的差異。ACI技術(shù)單純使用軟骨細(xì)胞懸液，由于缺少細(xì)胞外基質(zhì)的固定與支撐，最終再生的修復(fù)組織生物力學(xué)性能較差、耐磨持久性不佳。MACI技術(shù)使用Ⅰ/Ⅲ膠原為細(xì)胞支架材料，與天然軟骨基質(zhì)存在較大的差異，使用的支架成分為Ⅰ、Ⅲ膠原而不是透明軟骨中的Ⅱ型膠原，支架成分類似于皮膚而不是透明軟骨，因此形成的組織無論在結(jié)構(gòu)上還是成分上都與天然軟骨存在本質(zhì)差異。
　　我們課題組旨在研究出Ⅱ型膠原蛋白(COLⅡ)—硫

6、酸軟骨素(CS)—透明質(zhì)酸(HA)三者的仿生水凝膠，再確保生物安全的基礎(chǔ)上，與種子細(xì)胞（軟骨微粒）結(jié)合構(gòu)建仿生軟骨，用來修復(fù)小香豬的膝關(guān)節(jié)軟骨全層缺損，證實(shí)仿生凝膠復(fù)合軟骨微粒修復(fù)軟骨缺損的可行性。
　　研究方法:1、用高碘酸鈉氧化CS，對(duì)氧化的CS進(jìn)行紅外光譜檢測(cè);采用不同的比例制備COLⅡ-HA-CS仿生凝膠，得出最佳成膠比例。
　　2、取新西蘭大白兔，用軟骨微粒獲取裝置在兔子膝關(guān)節(jié)的股骨滑車處磨取軟骨微粒，將軟骨微?；?/p>

7、合于COLⅡ-HA-CS仿生凝膠中，在體外培養(yǎng)，在3d，7d，14d，21d，25d，30d取標(biāo)本，做組織切片HE染色，觀察到微粒中的軟骨細(xì)胞均存活情況。
　　3、取15頭貴州小豬，共30膝，隨機(jī)分為兩組，每組15膝，麻醉，鋪無菌單，逐步切開皮膚、關(guān)節(jié)囊，暴露關(guān)節(jié)滑車，用直徑8mm的套筒確定軟骨缺損范圍，用軟骨微粒獲取裝置獲取粒徑為100-200um的微粒并制作好直徑為8mm的軟骨全層缺損，以軟骨微粒:仿生凝膠為3∶1的比例混合均

8、勻，植入缺損區(qū)域，對(duì)照組為單純軟骨缺損。術(shù)后1、3、6月取標(biāo)本，分別進(jìn)行大體、體式顯微鏡及組織學(xué)觀察，同時(shí)用ICRS對(duì)大體組織和O'Driscoll組織學(xué)評(píng)分對(duì)軟骨缺損處的修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　研究結(jié)果:1、氧化的硫酸軟骨素從紅外光譜上看，氧化的硫酸軟骨素紅外光譜顯示:波長(zhǎng)在1750cm處出現(xiàn)新的吸收峰，其是醛基中的C=0吸收峰;以COLⅡ-HA∶CS按2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的比例成膠，最終以3∶1成膠的效果最好。

9、>　　2、軟骨微粒與仿生凝膠混合培養(yǎng)在3d，7d，14d，21d，25d，30d，取標(biāo)本做組織切片HE染色，觀察到微粒中的軟骨細(xì)胞均存活。
　　3、成功的將軟骨微粒復(fù)合仿生凝膠植入軟骨缺損，術(shù)后1月，對(duì)照組見少許修復(fù)組織形成，軟骨下鈣化層不連續(xù)，部分可見軟骨下骨破壞、塌陷，缺損處顏色為淡黃色。實(shí)驗(yàn)組見大部分修復(fù)組織覆蓋缺損，新生組織顏色接近正常軟骨顏色，術(shù)后3月及6月，對(duì)照組大體組軟骨表面粗糙，有裂隙存在，軟骨下骨塌陷，鈣化層不連

10、續(xù)。實(shí)驗(yàn)組大體及組織切片觀察發(fā)現(xiàn)修復(fù)組織完全覆蓋缺損，與周圍正常軟骨整合良好，表面光滑，細(xì)胞分布均。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1月ICRS評(píng)分:14±1.2，3月ICRS評(píng)分:17.8±1.31，術(shù)后6月ICRS評(píng)分:19.4±0.89;對(duì)照組術(shù)后1月ICRS評(píng)分:0.6±0.89，3月ICRS評(píng)分:12.4±2.4，術(shù)后6月ICRS評(píng)分:18.2±0.44;實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1月O'Driscoll評(píng)分:13±1.22，3月O'Driscoll評(píng)分:15.8

11、±1.30，術(shù)后6月O'Driscoll評(píng)分:17.2±0.84;對(duì)照組術(shù)后1月O'Driscoll評(píng)分:2.2±0.45，3月O'Driscoll評(píng)分:5.2±0.84，術(shù)后6月O'Driscoll評(píng)分:7.2±0.44（各時(shí)間點(diǎn)n=5，p＜0.05）。
　　研究結(jié)論:1、高碘酸鈉能夠氧化硫酸軟骨素，使硫酸軟骨素產(chǎn)生醛基基團(tuán)，氧化后的硫酸軟骨素能夠和膠原蛋白發(fā)生schiff-base交聯(lián)反應(yīng)，生成一種新型水凝膠。
　　2、