BMSC體外構建軟骨移植修復大動物關節(jié)軟骨缺損的可行性研究.pdf

1、目的：探討骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體外構建軟骨移植修復大動物大面積關節(jié)軟骨缺損的可行性，確定體外構建軟骨的最佳植入時間，以明確 BMSC體外構建軟骨用于關節(jié)軟骨缺損修復的臨床應用有效性。
　　方法與結果：
　　1．探索BMSC體外三維軟骨形成規(guī)律及評價軟骨形成質量
　　方法：取豬自體第二代BMSCs，以100×106的細胞濃度接種于聚羥基乙酸/

2、聚乳酸（Polyglycolic acid/Polylactic acid，PGA/PLA）圓盤形支架材料上，予軟骨定向誘導，分別于誘導2周、4周、6周、8周取樣行大體觀察、組織學、組織化學、免疫組織化學檢測，取誘導4周及8周的樣本行彈性模量測定、GAG含量及總膠原含量測定，探索 BMSC體外三維軟骨的形成規(guī)律，評價體外軟骨形成質量。結果：體外2周時，組織學染色未看到明顯的軟骨陷窩形成，II型膠原免疫組化染色及Saffranin-O染色

3、陰性。誘導到4周時形成外觀瓷白色的軟骨樣組織，組織學可見典型軟骨陷窩形成，II型膠原免疫組化染色及 Saffranin-O染色陽性。體外誘導6周，軟骨厚度及致密度較前明顯增加，II型膠原免疫組化染色及Saffranin-O染色強陽性。體外誘導8周時軟骨陷窩的數(shù)量與6周時基本一致，II型膠原免疫組化染色及Saffranin-O染色的著色程度較6周時稍有加深。體外4周時，楊氏模量為2.126±0.423MPa，達正常關節(jié)軟骨的13.6％；G

4、AG定量和總膠原定量分別為35.55±5.45mg/g、1.60±0.185mg/g，達正常關節(jié)軟骨的58.01%、44.12%。體外8周時，楊氏模量為5.157±0.539MPa，達正常關節(jié)軟骨的30.61%。GAG定量和總膠原定量分別為49.26±2.743mg/g、1.90±0.259mg/g，達正常關節(jié)軟骨的80.40%、54.67%。
　　2．BMSC體外構建軟骨移植修復關節(jié)軟骨缺損的可行性研究
　　方法：以貴州香

5、豬為動物模型，建立軟骨缺損模型，用自體 BMSC體外軟骨定向誘導8周的組織工程軟骨移植修復軟骨缺損，對照組則曠置作為空白對照。分別于修復術后3個月和6個月取材，行組織學、組織化學、免疫組織化學、GAG定量、總膠原定量等檢測。建立評價體系，評價修復效果，明確 BMSCs體外構建軟骨移植修復大動物關節(jié)軟骨缺損的可行性。結果：術后3個月取材提示實驗動物后肢無活動障礙，能正常站立、行走。實驗組修復區(qū)軟骨組織外觀與正常軟骨組織相近，與正常軟骨、軟

6、骨下骨等界面愈合良好，但軟骨厚度較正常軟骨組織厚。修復區(qū)組織學染色、Saffranin-O染、II型膠原免疫組織化學染色與正常軟骨組織相似?？瞻捉M則為結締組織修復。術后6個月取材部分實驗組實現(xiàn)了較理想的軟骨組織修復，修復區(qū)軟骨組織大體觀、組織學、組織化學及免疫組織化學與術后三個月相似，但更成熟、與正常軟骨組織更接近。GAG含量及總膠原含量測定提示其與正常關節(jié)軟骨無明顯差別（P＞0.05）。而部分實驗組則出現(xiàn)異常修復現(xiàn)象，外觀狀如空白對照

7、組，組織學提示為結締組織修復，空白對照組均無軟骨組織修復。
　　3．探索BMSC體外構建軟骨的最佳植入時間
　　方法：以貴州香豬為動物模型，建立軟骨缺損模型，用自體 BMSC體外三維軟骨誘導4周、8周的組織工程軟骨修復缺損部位，分別于修復術后3個月和6個月取材，按標準修復評價體系評價修復效果，比較體外構建4周、8周的組織工程軟骨其軟骨缺損修復效果，明確體外構建軟骨的最佳植入時間。結果：軟骨缺損修復術后3個月，實驗動物后肢能正

8、常站立、行走。體外4周組和體外8周組大體觀察、組織學、組織化學等均無顯著差異。術后6個月，實驗動物后肢活動基本正常，取材發(fā)現(xiàn)體外4周組及體外8周組都有約一半的缺損實現(xiàn)了軟骨組織修復，而另一半則為異常修復。有軟骨組織修復的4周組及8周組組織學、組織化學及II免疫組織化學染色與正常軟骨軟骨組織相近，GAG含量及總膠原含量與正常關節(jié)軟骨無顯著差異（P＞0.05）。
　　結論：1．誘導時間對BMSCs體外軟骨形成影響較大，在一定條件下隨著