BMSC體外構(gòu)建軟骨移植修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性研究.pdf

1、目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體外構(gòu)建軟骨移植修復(fù)大動(dòng)物大面積關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性，確定體外構(gòu)建軟骨的最佳植入時(shí)間，以明確 BMSC體外構(gòu)建軟骨用于關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)的臨床應(yīng)用有效性。
　　方法與結(jié)果：
　　1．探索BMSC體外三維軟骨形成規(guī)律及評(píng)價(jià)軟骨形成質(zhì)量
　　方法：取豬自體第二代BMSCs，以100×106的細(xì)胞濃度接種于聚羥基乙酸/

2、聚乳酸（Polyglycolic acid/Polylactic acid，PGA/PLA）圓盤形支架材料上，予軟骨定向誘導(dǎo)，分別于誘導(dǎo)2周、4周、6周、8周取樣行大體觀察、組織學(xué)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)，取誘導(dǎo)4周及8周的樣本行彈性模量測(cè)定、GAG含量及總膠原含量測(cè)定，探索 BMSC體外三維軟骨的形成規(guī)律，評(píng)價(jià)體外軟骨形成質(zhì)量。結(jié)果：體外2周時(shí)，組織學(xué)染色未看到明顯的軟骨陷窩形成，II型膠原免疫組化染色及Saffranin-O染色

3、陰性。誘導(dǎo)到4周時(shí)形成外觀瓷白色的軟骨樣組織，組織學(xué)可見典型軟骨陷窩形成，II型膠原免疫組化染色及 Saffranin-O染色陽(yáng)性。體外誘導(dǎo)6周，軟骨厚度及致密度較前明顯增加，II型膠原免疫組化染色及Saffranin-O染色強(qiáng)陽(yáng)性。體外誘導(dǎo)8周時(shí)軟骨陷窩的數(shù)量與6周時(shí)基本一致，II型膠原免疫組化染色及Saffranin-O染色的著色程度較6周時(shí)稍有加深。體外4周時(shí)，楊氏模量為2.126±0.423MPa，達(dá)正常關(guān)節(jié)軟骨的13.6％；G

4、AG定量和總膠原定量分別為35.55±5.45mg/g、1.60±0.185mg/g，達(dá)正常關(guān)節(jié)軟骨的58.01%、44.12%。體外8周時(shí)，楊氏模量為5.157±0.539MPa，達(dá)正常關(guān)節(jié)軟骨的30.61%。GAG定量和總膠原定量分別為49.26±2.743mg/g、1.90±0.259mg/g，達(dá)正常關(guān)節(jié)軟骨的80.40%、54.67%。
　　2．BMSC體外構(gòu)建軟骨移植修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性研究
　　方法：以貴州香

5、豬為動(dòng)物模型，建立軟骨缺損模型，用自體 BMSC體外軟骨定向誘導(dǎo)8周的組織工程軟骨移植修復(fù)軟骨缺損，對(duì)照組則曠置作為空白對(duì)照。分別于修復(fù)術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月取材，行組織學(xué)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、GAG定量、總膠原定量等檢測(cè)。建立評(píng)價(jià)體系，評(píng)價(jià)修復(fù)效果，明確 BMSCs體外構(gòu)建軟骨移植修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性。結(jié)果：術(shù)后3個(gè)月取材提示實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后肢無活動(dòng)障礙，能正常站立、行走。實(shí)驗(yàn)組修復(fù)區(qū)軟骨組織外觀與正常軟骨組織相近，與正常軟骨、軟

6、骨下骨等界面愈合良好，但軟骨厚度較正常軟骨組織厚。修復(fù)區(qū)組織學(xué)染色、Saffranin-O染、II型膠原免疫組織化學(xué)染色與正常軟骨組織相似?？瞻捉M則為結(jié)締組織修復(fù)。術(shù)后6個(gè)月取材部分實(shí)驗(yàn)組實(shí)現(xiàn)了較理想的軟骨組織修復(fù)，修復(fù)區(qū)軟骨組織大體觀、組織學(xué)、組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)與術(shù)后三個(gè)月相似，但更成熟、與正常軟骨組織更接近。GAG含量及總膠原含量測(cè)定提示其與正常關(guān)節(jié)軟骨無明顯差別（P＞0.05）。而部分實(shí)驗(yàn)組則出現(xiàn)異常修復(fù)現(xiàn)象，外觀狀如空白對(duì)照

7、組，組織學(xué)提示為結(jié)締組織修復(fù)，空白對(duì)照組均無軟骨組織修復(fù)。
　　3．探索BMSC體外構(gòu)建軟骨的最佳植入時(shí)間
　　方法：以貴州香豬為動(dòng)物模型，建立軟骨缺損模型，用自體 BMSC體外三維軟骨誘導(dǎo)4周、8周的組織工程軟骨修復(fù)缺損部位，分別于修復(fù)術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月取材，按標(biāo)準(zhǔn)修復(fù)評(píng)價(jià)體系評(píng)價(jià)修復(fù)效果，比較體外構(gòu)建4周、8周的組織工程軟骨其軟骨缺損修復(fù)效果，明確體外構(gòu)建軟骨的最佳植入時(shí)間。結(jié)果：軟骨缺損修復(fù)術(shù)后3個(gè)月，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后肢能正

8、常站立、行走。體外4周組和體外8周組大體觀察、組織學(xué)、組織化學(xué)等均無顯著差異。術(shù)后6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后肢活動(dòng)基本正常，取材發(fā)現(xiàn)體外4周組及體外8周組都有約一半的缺損實(shí)現(xiàn)了軟骨組織修復(fù)，而另一半則為異常修復(fù)。有軟骨組織修復(fù)的4周組及8周組組織學(xué)、組織化學(xué)及II免疫組織化學(xué)染色與正常軟骨軟骨組織相近，GAG含量及總膠原含量與正常關(guān)節(jié)軟骨無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：1．誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BMSCs體外軟骨形成影響較大，在一定條件下隨著