膠原蛋白支架復(fù)合自體BMSCs修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨缺損在醫(yī)學(xué)臨床上越來(lái)受到關(guān)注，其中就診人員多以運(yùn)動(dòng)員、體力勞動(dòng)者為主，普通人患病的幾率也呈現(xiàn)逐年增加趨勢(shì)[1-3]。除外傷病因外，手術(shù)切除（如腫瘤）、感染、痛風(fēng)及退變等也引起關(guān)節(jié)軟骨缺損，常表現(xiàn)為頑固性疼痛、關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙，嚴(yán)重者可喪失關(guān)節(jié)功能，已成為導(dǎo)致肢體殘廢和勞動(dòng)能力喪失的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。由于軟骨組織內(nèi)沒(méi)有血管供應(yīng)、神經(jīng)支配和淋巴回流，加之細(xì)胞成份單一，其自身修復(fù)能力非常有限，一旦損傷難于完全再生修復(fù)，

2、有報(bào)道顯示，直徑<3mm的軟骨缺損有可能部分或全部修復(fù)，直徑>4mm則不能自行修復(fù)[3]。針對(duì)軟骨缺損的治療，主要出于兩個(gè)目的：首先是要緩解關(guān)節(jié)疼痛和恢復(fù)關(guān)節(jié)功能；其次是阻止或至少延緩關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[4]。臨床治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的主要方法尚存在明顯不足[5]，例如，關(guān)節(jié)鏡下關(guān)節(jié)腔清術(shù)理只能暫時(shí)緩解疼痛癥狀，不能阻止病程發(fā)展；關(guān)節(jié)融合術(shù)將使關(guān)節(jié)功能喪失；人工關(guān)節(jié)置換術(shù)費(fèi)用昂貴，且翻修率較高；骨軟骨塊移植術(shù)雖然取得較好療效，但自體骨軟骨移植，拆

3、東墻補(bǔ)西墻，將認(rèn)為造成供區(qū)組織損傷；異體移植存在免疫排斥反應(yīng)和潛在疾病傳染等風(fēng)險(xiǎn)。
　　組織工程技術(shù)的快速發(fā)展，為關(guān)節(jié)軟骨缺損的治療提供了新思路[6]，但目前該技術(shù)仍然處于研究階段[7-10]。1984年瑞典醫(yī)學(xué)家Peterson[11]等首次報(bào)道在兔關(guān)節(jié)軟骨缺損模型中，用可吸收縫合線將自體骨膜縫合于軟骨缺損周緣，然后將自體軟骨細(xì)胞懸液注入缺損中，術(shù)后16周檢測(cè)證實(shí)關(guān)節(jié)軟骨缺損被透明軟骨修復(fù)，并將此方法稱為自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)（A

4、utologous Chondrocyte Transplantation，ACT）。1987年瑞典歌德堡醫(yī)療中心Brittberg[4]等報(bào)道采用該技術(shù)成功治療人關(guān)節(jié)軟骨缺損，這為隨后深入開(kāi)展的軟骨組織工程創(chuàng)造了有利條件。1995年美國(guó)Genzyme公司改良該技術(shù)用于制備較原始的軟骨組織工程產(chǎn)品，并注冊(cè)為Carticel?產(chǎn)品，1997年通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)后逐漸在臨床推廣應(yīng)用，至2004年已有3952名患者受益于該技術(shù)。2000年瑞典

5、Sahlgrenska醫(yī)院Peterson[12]等報(bào)告了101例膝關(guān)節(jié)軟骨缺損的患者接受ACT技術(shù)的治療情況，其中94例經(jīng)過(guò)2～9年隨訪，臨床有效率達(dá)87.5％以上；但同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在骨膜剝脫、細(xì)胞逸散及骨膜肥大等并發(fā)癥。后來(lái)Haddo等用一種Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架支架（Chondro-GideTM,Geistlich Biomaterials，Swiss）代替骨膜進(jìn)行對(duì)照研究，Chondro-GideTM這種產(chǎn)品提取于動(dòng)物皮膚膠原中，具有

6、較好的生物組織相容性、低免疫原性，其內(nèi)部分為兩層（光滑面和粗糙面），光滑面為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)，粗糙面可以有效的使細(xì)胞攀附，通過(guò)1年的隨訪證實(shí)方法具有良好的臨床療效，無(wú)骨膜肥大、剝脫等并發(fā)癥，同時(shí)此方法避免了因獲取骨膜而增加的額外創(chuàng)傷，該技術(shù)被視為第二代ACT技術(shù)（又稱為ACT-C），但是這種技術(shù)仍需要一次或多次手術(shù)取軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)[13-16]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，Verigen澳大利亞公司研發(fā)了MACI（matrix-i

7、nduced autologous chondrocyte implantation）技術(shù)，即第三代ACT技術(shù)用于治療多種原因引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損。該技術(shù)的基本過(guò)程為，在關(guān)節(jié)鏡下采集患者關(guān)節(jié)非負(fù)重區(qū)少量軟骨（約黃豆大?。┤缓筮M(jìn)行軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及增殖，最后將軟骨細(xì)胞種植在MACI?生物膜（Ⅰ/Ⅲ膠原膜）上構(gòu)建組織工程軟骨，移植到患者關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)。該技術(shù)取得較好療效同時(shí)克服了第一、二代ACT技術(shù)的缺點(diǎn)，研究目前尚處在探索階段。目前MAC

8、I技術(shù)存在不足的是，需要二次或二次以上手術(shù)，其中包括一次或多次手術(shù)取材（軟骨細(xì)胞）[17,18]，而且前期培養(yǎng)細(xì)胞的費(fèi)用昂貴，僅培養(yǎng)軟骨細(xì)胞一項(xiàng)就大約需要7000歐元，這無(wú)疑制約了其發(fā)展。
　　我國(guó)對(duì)組織工程軟骨的研究在總體上滯后于國(guó)外先進(jìn)水平，雖然在某些方面還是取得了令世人矚目成果，如1997年曹誼林等報(bào)道在裸鼠背上成功長(zhǎng)出具有人耳輪廓形狀的組織工程軟骨，但國(guó)目前尚無(wú)自主研發(fā)的組織工程軟骨應(yīng)用于臨床治療，同時(shí)也缺乏相應(yīng)的行業(yè)應(yīng)用

9、標(biāo)準(zhǔn)，從而嚴(yán)重限制了軟骨組織工程的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院關(guān)節(jié)外科中心自1997年開(kāi)始對(duì)組織工程軟骨進(jìn)行研究與開(kāi)發(fā)，并于國(guó)際上率先提出組織工程軟骨仿生構(gòu)建新理念，結(jié)構(gòu)仿生、成分仿生及功能仿生是該理念的精神。依據(jù)該理念，本研究選用關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)主要成分--Ⅱ型膠原蛋白為組織工程軟骨支架材料。根據(jù)臨床應(yīng)用微骨折技術(shù)治療軟骨缺損的原理，通過(guò)鉆孔使骨髓內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal stem cell

10、s，BMSCs）流至軟骨缺損區(qū)，利用局部微環(huán)境分化成軟骨細(xì)胞進(jìn)而修復(fù)軟骨缺損，本研究選用自體BMSCs為組織工程軟骨的種子細(xì)胞，并通過(guò)大動(dòng)物（山羊）實(shí)驗(yàn)研究，驗(yàn)證該策略的修復(fù)效果。
　　本研究在前期建立Ⅱ型膠原蛋白分離、純化的基礎(chǔ)上，繼續(xù)探索以Ⅱ型膠原蛋白為主要成分的組織工程軟骨支架材料制備技術(shù)；建立自體BMSCs分離、純化及擴(kuò)增技術(shù)；最后以國(guó)外Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架為對(duì)照，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究探討Ⅱ型膠原蛋白支架復(fù)合自體BMSCs治療

11、軟骨缺損的再生修復(fù)效果。
　　研究方法:
　　1．本實(shí)驗(yàn)以青山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物，在前期相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化BMSCs分離、純化技術(shù)，重點(diǎn)研究自體血清的分離、純化技術(shù)及采用自體血清培養(yǎng)BMSCs技術(shù)，以不同濃度自體血清作為培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)生長(zhǎng)周期及定向分化誘導(dǎo)做MSCs細(xì)胞鑒定。
　　2．對(duì)Ⅰ/Ⅲ型雙層膠原支架的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；以青山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物建立膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，15只12月齡山羊，隨機(jī)分為3組，

12、每組10例膝關(guān)節(jié)，A組為空白對(duì)照組，B組為單純Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架組，C組為Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架復(fù)合MSCs移植術(shù)組，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理；術(shù)后6周、24周取材，分別進(jìn)行大體觀察、組織學(xué)評(píng)分對(duì)各分組修復(fù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　3．從豬膝關(guān)節(jié)軟骨分離、純化Ⅱ型膠原，之后由低溫冷凍真空干燥制備成支架，對(duì)支架進(jìn)行體內(nèi)、體外生物相容性測(cè)試，掃描電鏡、組織學(xué)觀察支架結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5只山羊，觀察Ⅱ膠原支架復(fù)合細(xì)胞治療軟骨缺損研究，術(shù)后24周取材，評(píng)

13、價(jià)Ⅱ型膠原蛋白復(fù)合自體BMSCs治療軟骨缺損的再生修復(fù)效果。
　　研究結(jié)果:
　　1．本部分研究建立了自體血清制備技術(shù)和BMSCs分離、純化及擴(kuò)增技術(shù)。80ml山羊全血可獲取38.2±0.6ml血清，約占全血的50％。8ml骨髓可以分離出2×106個(gè)BMSCs，采用10％自體血清培養(yǎng)7天細(xì)胞數(shù)量增加6倍，與胎牛血清培養(yǎng)組無(wú)顯著差異；第2代細(xì)胞周期比例為：G1期79.32％，G2期12.12％，S期8.56％，說(shuō)明BMSCs具

14、有較強(qiáng)的增殖能力；成骨和成軟骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明采用自體血清培養(yǎng)的BMSCs具有多向分化潛能。
　　2．成功建立山羊膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型和Ⅰ/Ⅲ型雙層膠原支架復(fù)合自體BMSCs植入技術(shù)。術(shù)后24周MRI示關(guān)節(jié)腔無(wú)積液、滑膜無(wú)增生，實(shí)驗(yàn)組修復(fù)組織與正常軟骨信號(hào)無(wú)區(qū)別；大體觀察修復(fù)組織與正常軟骨持平，顏色與與正常軟骨相似。組織學(xué)證實(shí)修復(fù)組織為透明軟骨。Wakitani評(píng)分實(shí)驗(yàn)組為2.55±1.02，明顯好于單純支架組（7.06±1.13）和空

15、白對(duì)照組（10.25±1.38）?？瞻讓?duì)照組和單純支架組修復(fù)效果較差。
　　3．成功建立以Ⅱ型膠原蛋白為材料的組織工程軟骨支架制備技術(shù)，采用該技術(shù)制備的Ⅱ型膠原支架孔徑約40-130μm，孔隙率約90％以上并且孔通率較好，細(xì)胞材料共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和兔背部皮下植入實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ⅱ型膠原支架具有良好的細(xì)胞相容性和組織相容性。建立了Ⅱ型膠原蛋白復(fù)合BMSCs體外構(gòu)建及培養(yǎng)技術(shù)以及體內(nèi)植入技術(shù)。術(shù)后24周大體觀察，大體觀察修復(fù)組織顏色與正常軟骨相似，

16、與正常軟骨整合良好。組織學(xué)證實(shí)為透明軟骨。Wakitani評(píng)分為1.86±0.28，明顯好于Ⅰ/Ⅲ型膠原支架復(fù)合細(xì)胞組（2.55±1.02）和空白對(duì)照組（11.42±1.26）。
　　研究結(jié)論:
　　1．建立了自體血清制備技術(shù)，80ml羊全血可獲取38.2±0.6ml血清，約占全血的50％。
　　2．建立了BMSCs分離、純化及自體血清培養(yǎng)技術(shù)。8ml骨髓可以分離出2×106個(gè)BMSCs，采用10％自體血清培養(yǎng)7天細(xì)胞

17、數(shù)量增加6倍，與胎牛血清培養(yǎng)組無(wú)顯著差異；且培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSCs具有較強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能。
　　3．建立羊麻醉和復(fù)蘇技術(shù)，為以羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物提供了技術(shù)方法。建立了膝關(guān)節(jié)全厚軟骨缺損模型，為組織工程軟骨動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提供了良好的評(píng)價(jià)平臺(tái)。
　　4．建立了以Ⅱ型膠原蛋白為材料組織工程軟骨支架制備技術(shù)，采用該技術(shù)制備的Ⅱ型膠原支架孔徑約40-130μm，孔隙率約90％以上并且孔通率較好，細(xì)胞材料共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和兔背部皮下植入實(shí)驗(yàn)證

18、實(shí)Ⅱ型膠原支架具有良好細(xì)胞相容性和組織相容性。
　　5．以Ⅰ/Ⅲ型雙層膠原支架復(fù)合自體BMSCs植入技術(shù)加軟骨下骨微骨折技術(shù)可以修復(fù)直徑為6mm全層軟骨缺損。術(shù)后24周關(guān)節(jié)腔無(wú)積液、滑膜無(wú)增生，組織學(xué)證實(shí)修復(fù)組織為混合樣軟骨。
　　6．將BMSCs接種于Ⅱ型膠原蛋白支架體外培養(yǎng)5天，植入體內(nèi)可修復(fù)直徑為6mm全層軟骨缺損，修復(fù)結(jié)果為透明樣軟骨，Wakitani評(píng)分為1.86±0.28，明顯好于Ⅰ/Ⅲ型膠原支架復(fù)合細(xì)胞組（2.