一種新型Rab-like蛋白mRabL5的多克隆抗體制備及生物學功能初探.pdf

1、Rab蛋白家族是Ras超家族(包括ras， rho/rac， rab， arf以及ran五大類)中最大的家族，是一類小分子量GTP酶，分子量大都在20～25kDa之間，表達于從酵母、果蠅、小鼠到人類等各種真核生物中，調節(jié)細胞器之間的囊泡運輸。其在酵母中稱為YPT/SEC，在高等真核生物中稱為Rab。到目前為止，已有近70多種人類Rab蛋白或Rab-like蛋白編碼基因被克隆和鑒定，其中包括一些剪切體。 細胞內的囊泡運輸是一個重

2、要而又復雜的過程，這就意味著有多種Rab蛋白參與其中的調節(jié)。對新型Rab蛋白的研究，必將有助于我們進一步了解囊泡運輸。本課題所研究的新基因mRabL5(GenBank登錄號：NM 026073)，編碼一個預計分子量為20.7kDa的新型鼠源Rab-like蛋白。前期實驗分析表明，mRabL5具備Rab蛋白家族的許多保守序列，并具有GTP酶活性。 為了更好地研究 mRabL5在囊泡運輸中的作用，我們制備了針對mRabL5的多克隆

3、抗體，并利用自制的抗體檢測了mRabL5在小鼠組織中的表達情況，同時揭示了mRabL5的亞細胞定位，初步推測了其在囊泡運輸中的功能，結果如下： 1、制備了針對mRabL5特異性較好的多克隆抗體。我們利用谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)融合表達載體，將mRabL5基因全長及C端分別重組到原核表達載體pGEX-4T-1中，陽性的重組子在大腸桿菌表達菌株。RoseRa中進行IPTG誘導表達。誘導表達后的兩種可溶性融合蛋白用Sepharo

4、se 4B進行親和純化。純化后的融合蛋白分別免疫家兔，獲得了多克隆抗血清并經(jīng)G蛋白親和純化。通過ELISA檢測，自制的抗體效價高。westem blot及免疫熒光結果表明兩種自制的抗體能識別真核細胞表達的mRabL5蛋白，針對C端制備的抗體具備更好的特異性，實驗檢測非特異性信號少，是后續(xù)實驗研究的理想工具。 2、組織廣譜表達的mRabL5與反面高爾基體網(wǎng)狀結構共定位。通過westemblot及組織切片免疫熒光實驗，我們在小鼠各

5、主要組織都檢測到mRabL5的表達，表明其是一個廣譜表達的Rab-like蛋白。利用高爾基復合體特異性指示探針C<,6>-NBD-Ceramid，通過免疫熒光檢測，我們發(fā)現(xiàn)mRabL5在細胞內聚集于核周一側的分布形式與高爾基復合體的亞細胞定位一致。進一步我們用反面高爾基體網(wǎng)狀結構(TGN)特異性指示探針發(fā)現(xiàn)，Nocodazole處理，能同時引起TGN與mRabL5亞細胞定位發(fā)生離散。除去Nocodazole后，兩者恢復核周一側聚集的共分

6、布形式。而用兩種內質網(wǎng)標記物：DiOC<,6>、Texas red-labeled ConA，我們沒有檢測到mRabL5與之的共定位現(xiàn)象。Lyso Tracker Red標記的溶酶體與mRabL5也不呈現(xiàn)共定位。以上結果提示，作為一種組織廣譜表達的Rab-like蛋白，mRabL5可能參與調節(jié)TGN有關的囊泡運輸。 3、mRabL5參與內吞途徑。我們通過超速離心進行細胞組分分餾，發(fā)現(xiàn)mRabL5在細胞內有胞質可溶及膜結合兩種存

7、在形式。加入TRITC-WGA促進細胞內吞途徑后，mRabL5在可溶性胞質及內膜系統(tǒng)中的分布比例發(fā)生變化。同時，通過免疫熒光實驗，我們檢測到內吞途徑促進過程中，mRabL5與含有WGA結合位點的內涵體共定位。以上結果表明，mRab5在細胞內循環(huán)于膜系統(tǒng)和胞質之間，參與TRTIC-WGA的內吞轉運過程。 綜上所述，我們制備了兩種多克隆抗體，針對C端的多克隆抗體具有更好的抗原特異性。利用該抗體，我們檢測到mRabL5是一個廣譜表達