Copine-8蛋白功能的初步探究及其多克隆抗體制備.pdf

1、從前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的copine-8蛋白（基因名CPNE8）是copines蛋白家族的成員之一。Copines蛋白家族是一類Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，該蛋白家族成員在多種生物中都表達，并且各成員之間具有較高的同源性。Copines蛋白家族具有共同的結構特性:兩個結構相似的C2結構域和一個血友病因子結構域(von Willebrand factor A)，簡稱A結構域(vWA)。本研究初步探索copine-8蛋白對腫瘤細胞生長和遷移的影響

2、及其在細胞中的定位，并制備了copine-8蛋白多克隆抗體，為深入探究copine-8蛋白的生物學功能奠定基礎。
　　本實驗首先培養(yǎng)人子宮頸癌Hela細胞，從Hela細胞中提取總RNA，通過RT-PCR擴增獲得CPNE8基因。利用限制性內切酶酶切真核表達載體pEGFP-N1、原核表達載體pGEX-4T-1以及CPNE8基因，用T4連接酶構建重組質粒并驗證。將經(jīng)驗證正確的真核表達載體pEGFP-N1/CPNE8瞬時轉染H1299細胞

3、后，通過平板單克隆形成實驗檢測細胞增殖的差異，并采用transwell細胞遷移實驗檢測細胞遷移能力的差異。同時，將構建好的真核表達載體pEGFP-N1/CPNE8瞬時轉染人源胚胎腎細胞293T，通過激光共聚焦觀察，確定copine-8蛋白在293T細胞中的亞定位。運用同樣的方法確定copine-8蛋白在肺腺癌細胞H1299中的定位。此外，將經(jīng)驗證正確的原核表達載體pGEX-4T-1/CPNE8轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)

4、和E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)，誘導表達GST-copine-8融合蛋白，初步確定GST-copine-8融合蛋白的優(yōu)勢表達菌株以及誘導表達的條件。大量誘導表達GST-copine-8融合蛋白，超聲破碎菌體獲得GST-copine-8包涵體，純化回收該融合蛋白后注射新西蘭大白兔制備多克隆抗體血清并檢測。
　　實驗最終獲得表達人源copine-8蛋白的基因-CPNE8，凝膠電泳顯示單一條帶。連接、轉化、培養(yǎng)后，經(jīng)抗生

5、素篩選得到的陽性克隆菌落用菌體PCR以及酶切驗證，在預期位置有相應的特異性條帶;同時，重組質粒送至公司進行DNA序列測定，經(jīng)BLAST比對，產(chǎn)物序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的CPNE8基因序列一致，表明成功構建重組質粒pEGFP-N1/CPNE8和pGEX-4T-1/CPNE8。統(tǒng)計學分析轉染重組質粒pEGFP-N1/CPNE8的H1299細胞增殖數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)瞬時過表達copine-8蛋白的H1299細胞與對照組相比，其細胞數(shù)量極顯著上升

6、，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。該結果表明過表達copine-8蛋白能提高H1299細胞體外增殖的能力。統(tǒng)計分析transwell實驗中上述細胞的遷移數(shù)量差異，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，瞬時轉染pEGFP-N1/CPNE8的H1299細胞穿過transwell小室的細胞數(shù)減少，細胞遷移數(shù)量極顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。該結果表明copne-8蛋白能抑制H1299細胞的遷移能力。通過激光共聚焦觀察轉染pEGFP-N1/

7、CPNE8的293T細胞和H1299細胞，在293T細胞中綠色熒光幾乎都分布在細胞膜上，少量分布在細胞質內;在H1299細胞中綠色熒光絕大多數(shù)分布在細胞膜上，說明copine-8蛋白定位在腫瘤細胞的細胞膜上。將制備好的copine-8多克隆抗體用間接ELISA法檢測，發(fā)現(xiàn)其效價可達到1∶10000以上。Westernb lotting結果顯示，此多克隆抗體可特異性識別外源表達的copine-8蛋白并可用于免疫組化檢測copine-8蛋白