Copine-8蛋白功能的初步探究及其多克隆抗體制備.pdf

1、從前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的copine-8蛋白（基因名CPNE8）是copines蛋白家族的成員之一。Copines蛋白家族是一類(lèi)Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，該蛋白家族成員在多種生物中都表達(dá)，并且各成員之間具有較高的同源性。Copines蛋白家族具有共同的結(jié)構(gòu)特性:兩個(gè)結(jié)構(gòu)相似的C2結(jié)構(gòu)域和一個(gè)血友病因子結(jié)構(gòu)域(von Willebrand factor A)，簡(jiǎn)稱(chēng)A結(jié)構(gòu)域(vWA)。本研究初步探索copine-8蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響

2、及其在細(xì)胞中的定位，并制備了copine-8蛋白多克隆抗體，為深入探究copine-8蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)首先培養(yǎng)人子宮頸癌Hela細(xì)胞，從Hela細(xì)胞中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得CPNE8基因。利用限制性?xún)?nèi)切酶酶切真核表達(dá)載體pEGFP-N1、原核表達(dá)載體pGEX-4T-1以及CPNE8基因，用T4連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒并驗(yàn)證。將經(jīng)驗(yàn)證正確的真核表達(dá)載體pEGFP-N1/CPNE8瞬時(shí)轉(zhuǎn)染H1299細(xì)胞

3、后，通過(guò)平板單克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖的差異，并采用transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的差異。同時(shí)，將構(gòu)建好的真核表達(dá)載體pEGFP-N1/CPNE8瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人源胚胎腎細(xì)胞293T，通過(guò)激光共聚焦觀察，確定copine-8蛋白在293T細(xì)胞中的亞定位。運(yùn)用同樣的方法確定copine-8蛋白在肺腺癌細(xì)胞H1299中的定位。此外，將經(jīng)驗(yàn)證正確的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1/CPNE8轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)

4、和E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)，誘導(dǎo)表達(dá)GST-copine-8融合蛋白，初步確定GST-copine-8融合蛋白的優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌株以及誘導(dǎo)表達(dá)的條件。大量誘導(dǎo)表達(dá)GST-copine-8融合蛋白，超聲破碎菌體獲得GST-copine-8包涵體，純化回收該融合蛋白后注射新西蘭大白兔制備多克隆抗體血清并檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)最終獲得表達(dá)人源copine-8蛋白的基因-CPNE8，凝膠電泳顯示單一條帶。連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)后，經(jīng)抗生

5、素篩選得到的陽(yáng)性克隆菌落用菌體PCR以及酶切驗(yàn)證，在預(yù)期位置有相應(yīng)的特異性條帶;同時(shí)，重組質(zhì)粒送至公司進(jìn)行DNA序列測(cè)定，經(jīng)BLAST比對(duì)，產(chǎn)物序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的CPNE8基因序列一致，表明成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1/CPNE8和pGEX-4T-1/CPNE8。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N1/CPNE8的H1299細(xì)胞增殖數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)過(guò)表達(dá)copine-8蛋白的H1299細(xì)胞與對(duì)照組相比，其細(xì)胞數(shù)量極顯著上升

6、，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。該結(jié)果表明過(guò)表達(dá)copine-8蛋白能提高H1299細(xì)胞體外增殖的能力。統(tǒng)計(jì)分析transwell實(shí)驗(yàn)中上述細(xì)胞的遷移數(shù)量差異，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/CPNE8的H1299細(xì)胞穿過(guò)transwell小室的細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞遷移數(shù)量極顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。該結(jié)果表明copne-8蛋白能抑制H1299細(xì)胞的遷移能力。通過(guò)激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)染pEGFP-N1/

7、CPNE8的293T細(xì)胞和H1299細(xì)胞，在293T細(xì)胞中綠色熒光幾乎都分布在細(xì)胞膜上，少量分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi);在H1299細(xì)胞中綠色熒光絕大多數(shù)分布在細(xì)胞膜上，說(shuō)明copine-8蛋白定位在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上。將制備好的copine-8多克隆抗體用間接ELISA法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其效價(jià)可達(dá)到1∶10000以上。Westernb lotting結(jié)果顯示，此多克隆抗體可特異性識(shí)別外源表達(dá)的copine-8蛋白并可用于免疫組化檢測(cè)copine-8蛋白