CDK11p58自身結(jié)構(gòu)功能及其對甾體類激素受體雄激素受體、維生素D受體調(diào)控的研究.pdf

1、第一、二部分CDK11p58對雄激素受體AR、維生素D受體VDR轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)等相關(guān)生物學(xué)功能機(jī)制研究
　　細(xì)胞周期素依賴的激酶11(p58)(CDK11p58，p58PITSLRE，p58GTA，p58clk-1)是最早被發(fā)現(xiàn)的CDK11家族蛋白，在β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1分離純化過程中得到，能與β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1相互作用，并磷酸化β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1，對其活性起增強(qiáng)作用。CDK11p58是p34cdc2相關(guān)

2、激酶超家族的一員，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)于G2/M期，并且過表達(dá)CDK11p58能導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢，形態(tài)發(fā)生變化，有絲分裂障礙，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期。CDK11p58具有促凋亡作用，且該作用與其激酶活性密切相關(guān)。雖然CDK11p58在細(xì)胞生長中發(fā)揮著負(fù)調(diào)控因子的重要作用，但是它的上游調(diào)控因子和下游的效應(yīng)分子還沒有被發(fā)現(xiàn)。
　　雄激素和雄激素受體AR(androgenreceptor)組成的信號(hào)通路對于

3、男性個(gè)體生殖系統(tǒng)及其它組織器官的發(fā)育、分化，以及男性腫瘤如前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展影響密切。作為核受體家族的成員之一，AR在結(jié)合了雄激素后，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的活性。我們研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58能夠抑制雄激素受體轉(zhuǎn)錄活性以及人前列腺癌細(xì)胞中的前列腺特異抗原PSA(prostatespecificantigen)的表達(dá)及分泌。AR，細(xì)胞周期素cyclinD3，CDK11p58三者可以在細(xì)胞中形成三元復(fù)合物，共定位于前

4、列腺以及睪丸的上皮細(xì)胞中。雄激素受體的活性可以被其特殊位點(diǎn)的磷酸化調(diào)控，我們研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以在體內(nèi)體外磷酸化AR，并明確其磷酸化位點(diǎn)是Ser-308，CDK11p58通過對于AR的磷酸化作用，影響該激素受體的信號(hào)通路，從而產(chǎn)生一系列生物學(xué)活性，影響AR的轉(zhuǎn)錄活性以及前列腺癌細(xì)胞的生長凋亡變化。
　　維生素D受體VDR(vitaminD3receptor)同雄激素受體AR一樣，也是核受體超家族中的一員，屬于類固醇激素、甲

5、狀腺激素和脂溶性維生素A和D核受體超家族的成員，主要與其他共調(diào)節(jié)子一起負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮重要作用。在真核細(xì)胞中，VDR通過其配體1，25-(OH)2D3產(chǎn)生生理功能，1，25-(OH)2D3是維生素D的激素形式，主要負(fù)責(zé)調(diào)控體內(nèi)鈣的動(dòng)態(tài)平衡。VDR與1，25-(OH)2D3結(jié)合導(dǎo)致其構(gòu)型發(fā)生改變，從而由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，與RXR形成異源二聚體[14]。該異源二聚體進(jìn)一步結(jié)合靶基因啟動(dòng)子上的維生素D反應(yīng)元件VDRE，從而調(diào)控其

6、轉(zhuǎn)錄。
　　以往我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)cyclinD3可以調(diào)控維生素D受體，影響其表達(dá)，而CDK11p58，作為cylinD3的伴侶激酶蛋白，可以調(diào)節(jié)AR的活性，那么CDK11p58對于VDR是否也存在一定的調(diào)控作用呢，這便是我們進(jìn)一步的研究重點(diǎn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58激酶可以與VDR相互作用，抑制VDR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58激酶可以通過促進(jìn)VDR的泛素化降解降低其蛋白穩(wěn)定性。這些研究結(jié)果充分說明CDK11

7、p58激酶對于VDR轉(zhuǎn)錄因子存在一種負(fù)調(diào)控作用。這些結(jié)果對于更好的理解CDK11p58如何調(diào)節(jié)VDR的蛋白水平及轉(zhuǎn)錄起到重要作用，對于進(jìn)一步研究其對甾體類激素受體的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分CDK11p58自身磷酸化位點(diǎn)Thr-370磷酸化作用與激酶活性及細(xì)胞凋亡相關(guān)
　　細(xì)胞周期依賴激酶11(PITSLRE蛋白激酶)，是細(xì)胞周期依賴激酶超家族的一員，主要功能有細(xì)胞周期阻滯，促癌變，促凋亡等，而這些功能往往都與其自身

8、激酶活性相關(guān)。其中有兩種蛋白，CDK11p110和CDK11p58，它們從相同的轉(zhuǎn)錄子中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，只是CDK11p588起始密碼子AUG不同，造成二者分子量的差異。CDK11p110/CDK11p58激酶在細(xì)胞存活和早期胚胎發(fā)育過程中是必需的。
　　CDK11p58包含-保守的p34cdc2相關(guān)Ser/Thr蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，主要位于80-389位氨基酸，同時(shí)在結(jié)構(gòu)中還包含N端和C端結(jié)構(gòu)域。CDK11p58盡管也含有與CDK11

9、p110C端相同的激酶活性結(jié)構(gòu)域，但二者功能卻完全不同。CDK11p110蛋白激酶在整個(gè)細(xì)胞周期中都有穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)，主要功能在于調(diào)控前RNA剪接和RNA轉(zhuǎn)錄。相反，分子量較小的CDK11p58卻在細(xì)胞周期的G2/M期中特異表達(dá)，主要功能是以激酶活性依賴的方式調(diào)控細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡。中華鼠中過表達(dá)CDK11p58可以導(dǎo)致晚期分裂延長，異常染色體分離，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞增長率。CDK11p58對于姐妹染色體粘合也是必需的。最新研究

10、還發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以促進(jìn)中心體成熟和紡錘體形成。
　　以往研究表明CDK11p58可以在凋亡信號(hào)中發(fā)揮啟動(dòng)作用，而在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的Fas介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和凋亡過程中，可以被多種caspases在蛋白末端結(jié)構(gòu)域中發(fā)生剪接。我們實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以促進(jìn)CHX誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的凋亡；CDK11p58在凋亡過程中以激酶活性依賴的方式下調(diào)Bcl-2的表達(dá)：同時(shí)CDK11p58可以cyclinD3相互作用，調(diào)

11、節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展；而cyclinD3/CDK11p58復(fù)合物通過磷酸化AR參與其負(fù)調(diào)控，進(jìn)而抑制雄激素依賴的前列腺癌細(xì)胞的增殖；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58也參與調(diào)控了雌激素受體ER和VDR甾體類激素受體的負(fù)調(diào)控，只是具體的調(diào)控機(jī)制并不相同。
　　盡管CDK11p58在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮如此重要的作用，但是該蛋白在細(xì)胞中功能的基礎(chǔ)，比如蛋白結(jié)構(gòu)以及一些機(jī)制問題，我們卻知之甚少。在本研究中，我們首次研究發(fā)現(xiàn)CDK11p58可以發(fā)

12、生自身磷酸化，并且可以自身相互作用，在細(xì)胞內(nèi)形成同源二聚體。但是其激酶活性缺失的點(diǎn)突變D224N，卻無法自身相互作用形成二聚體。然后我們利用點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)一步明確了自身磷酸化位點(diǎn)是Thr-370。進(jìn)行點(diǎn)突變后，T370A無法自身磷酸化并且喪失激酶活性。更有趣的是，T370A同時(shí)也無法抑制AR轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，該突變體也喪失促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。這些研究進(jìn)一步說明Thr-370位點(diǎn)的自身磷酸化與激酶活性和其生物學(xué)功能比如細(xì)胞凋亡及雄激素受體調(diào)控