Hsf4在晶狀體上皮細胞中的抗凋亡分子機制.pdf

1、背景：熱休克反應（HSR）是生物機體在應激狀態(tài)下所表現的，以熱休克蛋白誘導表達為特征的自我保護反應。熱休克蛋白應用其分子伴侶活性對修飾應激而致的變性蛋白結構的正確折疊或引領變性蛋白在溶酶體，Ubquitin-proteasome降解，從而穩(wěn)定細胞的內穩(wěn)態(tài)。熱休克反應主要受熱休克轉錄因子（HSF）調控。熱休克轉錄因子結合基因啟動子的熱休克元件調節(jié)表達熱休克蛋白基因的轉錄表達。哺乳類動物表達4個 HSF家族成員。Hsf4是這個家族成員之一，

2、是晶狀體中執(zhí)行熱休克反應的主要轉錄因子。有研究發(fā)現， Hsf4功能異常導致晶狀體分化異常和白內障的發(fā)生。
　　白內障分為先天性白內障和老年性白內障。先天性白內障是胚胎時期晶狀體發(fā)育異常所致，其發(fā)育過程伴隨很多的凋亡發(fā)生；老年性白內障為白內障主要類型，占白內障病人的80％，75歲以上的老年人患病率為70%，其病因是晶狀體受到外界的高溫，缺氧，紫外照射等不良環(huán)境的影響，促使晶狀體蛋白變性甚至導致細胞凋亡引起的。Hsf4是調控晶狀體發(fā)育

3、的關鍵因子， Hsf4a和 Hsf4b是其兩種亞型，其中 Hsf4b是調節(jié)晶狀體發(fā)育的唯一亞型。我們前期研究結果發(fā)現，在晶狀體上皮細胞內，Hsf4參與調控αB-crystallin和 Hsp25等小分子伴侶的表達。Roxana Chis發(fā)現，小鼠心肌細胞受到 H2O2刺激后，αB-crystallin能從細胞胞質中轉移到線粒體膜上，并且與 VDAC, TOM20，caspase3和caspase12相互作用，從而抵抗H2O2刺激導致的細

4、胞凋亡。其它研究也證明了αB-crystallin在心肌細胞與小鼠子宮內膜間質細胞中，與線粒體凋亡通路直接作用，抵抗內質網折疊壓力，過氧化和炎癥等各種細胞壓力導致的細胞凋亡。因此，推論 Hsf4b通過上調αB-crystallin蛋白表達，抑制外界誘導的晶狀體細胞凋亡。本課題利用敲除和過表達Hsf4b的晶狀體上皮細胞，進一步探討Hsf4b在晶狀體上皮細胞中的抗凋亡的分子機制。
　　目的：研究晶狀體上皮細胞中， Hsf4及其下游蛋白

5、αB-crystallin抵抗細胞凋亡具體的分子機制。
　　方法：
　　1.用caspase-3檢測試劑盒檢測caspase-3的活性，用免疫印跡檢測cleaved caspase-3和hsf4b下游相關基因的蛋白水平和ERK和p-ERK的蛋白水平，。
　　2.利用線粒體膜電位檢測試劑盒檢測線粒體膜電位。
　　3.利用線粒體分離實驗，免疫印跡檢測線粒體蛋白和胞質蛋白中細胞色素 C和Hsf4b下游蛋白αB-crys

6、tallin的蛋白量。
　　4.用免疫熒光實驗觀察細胞色素C、Bax、αB-crystallin和線粒體的共定位。
　　5.用流式細胞術檢測細胞凋亡。
　　6. pull-down實驗驗證了αB-crystallin與細胞色素C和促凋亡因子Bax存在相互作用。
　　7.用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內的活性氧水平。
　　結果：在晶狀體上皮細胞中，Hsf4b具有穩(wěn)定線粒體膜勢（ΔΨ），抑制順鉑，雙氧水刺激誘導的細