P物質(zhì)小干擾RNA在變應(yīng)性鼻炎基因治療中的作用機制研究.pdf

1、變應(yīng)性鼻炎(Allergic rhinitis,AR)又稱過敏性鼻炎,是耳鼻喉科常見病、多發(fā)病,人群發(fā)病率高達(dá)5-15％,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前研究表明,變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中存在多種基因的異常表達(dá),其中,P物質(zhì)(Substance P,SP)基因的異常表達(dá)與變應(yīng)性鼻炎嚴(yán)重程度密切相關(guān)。
　　調(diào)節(jié)異常致病基因的表達(dá)是治療基因相關(guān)疾病的重要途徑,而近年來逐漸興起的小干擾RNA技術(shù)則為這類疾病的基因治療提供了很好的技術(shù)支持。小干擾RN

2、A技術(shù)主要是通過設(shè)計同目的基因mRNA相對應(yīng),長度為21-25bp的短RNA序列,以雙鏈的dsRNA或shRNA的形式導(dǎo)入細(xì)胞,導(dǎo)入的dsRNA可被Dicer酶消化生成siRNA,或shRNA表達(dá)產(chǎn)生針對目的mRNA的特異序列的siRNA,siRNA進(jìn)一步同目的mRNA及核酸酶結(jié)合形成完全的RNA沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC),激活并降解目的mRNA,抑制該基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。siRN

3、A技術(shù)作為一種高效、特異抑制靶基因表達(dá)的方法,既可以用來對目的基因進(jìn)行功能研究,亦可作為疾病基因治療的手段。
　　為了研究P物質(zhì)在變應(yīng)性鼻炎發(fā)病中的作用并探討SP基因治療在變應(yīng)性鼻炎治療中的作用,我們利用siRNA技術(shù),分別在細(xì)胞水平和動物整體水平對P物質(zhì)siRNA(SP-siRNA)在變應(yīng)性鼻炎的作用進(jìn)行研究探討。
　　我們首先對人,大鼠,小鼠的P物質(zhì)mRNA序列進(jìn)行對比分析并使用Whitehead Institute f

4、or Biomedical Research的siRNA設(shè)計軟件設(shè)計針對P物質(zhì)mRNA保守區(qū)域的siRNA序列共3條。為驗證設(shè)計序列的有效性,我們選取變應(yīng)性疾病研究中常用的肥大細(xì)胞-RBL-2H3細(xì)胞為對象,進(jìn)行P物質(zhì)siRNA干預(yù)研究。我們首先通過real time PCR、細(xì)胞免疫熒光的方法證明肥大細(xì)胞RBL-2H3中存在有內(nèi)源性P物質(zhì)表達(dá),并發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)的表達(dá)在外源DNP-IgE激活后表達(dá)增加;針對軟件設(shè)計的3組P物質(zhì)siRNA序列

5、,我們使用siRNA研究中廣泛應(yīng)用的shRNA表達(dá)載體psilencer 4.1 CMV neo,合成并構(gòu)建了對應(yīng)的3組P物質(zhì)shRNA表達(dá)載體及1組陰性對照shR/NA(Negative control-shRNA,NC-shRNA)表達(dá)載體,通過克隆擴增,制備并抽提4組shRNA質(zhì)粒;通過細(xì)胞電轉(zhuǎn)化的方法,分別將3組shRNA以及陰性對照shRNA瞬時轉(zhuǎn)染入肥大細(xì)胞RBL-2H3;同時對shRNA載體轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞使

6、用DNP-IgE刺激,通過real time-PCR及細(xì)胞免疫熒光的方法,檢測IgE刺激后,肥大細(xì)胞RBL-2H3內(nèi)P物質(zhì)表達(dá)情況,篩選出干擾效果最佳的SP-shRNA2載體作為最佳的轉(zhuǎn)染載體,對應(yīng)的序列為高效的P物質(zhì)小干擾RNA序列。對SP-shRNA2、陰性對照NC-shRNA轉(zhuǎn)染后的肥大細(xì)胞RBL-2H3,通過β-hexosaminidase實驗檢測不同shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對肥大細(xì)胞RBL-2H3脫顆粒能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照s

7、hRNA轉(zhuǎn)染組相比,轉(zhuǎn)染P物質(zhì)shRNA后,肥大細(xì)胞RBL-2H3脫顆粒釋放β-hexosaminidase水平降低,說明P物質(zhì)shRNA作用后可顯著抑制肥大細(xì)胞RBL-2H3的脫顆粒能力。
　　依照細(xì)胞實驗結(jié)果,我們選取對P物質(zhì)mRNA抑制表達(dá)效率最高的shRNA2序列,依照其對應(yīng)的siRNA序列合成化學(xué)修飾的P物質(zhì)siRNA(SP-siRNA),給予變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻腔給藥,進(jìn)行動物整體水平的小干擾RNA治療研究。我們將BABL

8、/C小鼠分別分為:
　　1)變應(yīng)性鼻炎SP-siRNA干預(yù)組;
　　2)變應(yīng)性鼻炎陰性對照siRNA干預(yù)組(Negative control-siRNA,NC-siRNA);
　　3)變應(yīng)性鼻炎未干預(yù)組。
　　對模型小鼠分別進(jìn)行4次的腹腔注射致敏后,按照siRNA鼻腔給藥干預(yù)/OVA鼻腔激發(fā)/OVA鼻腔激發(fā)/OVA鼻腔激發(fā)的順序依次進(jìn)行干預(yù)和激發(fā)操作,共進(jìn)行4次干預(yù),最后一次鼻腔激發(fā)后,麻醉小鼠并提取血清、收集鼻

9、黏膜樣本。分別通過ELISA,免疫組化,病理染色,real time RT-PCR,抗體芯片等方法檢測P物質(zhì)siRNA干預(yù)后,動物鼻腔鼻黏膜局部P物質(zhì)表達(dá)、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤、嗜酸性顆粒釋放及變應(yīng)性鼻炎相關(guān)炎癥因子的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),P物質(zhì)siRNA干預(yù)后,小鼠鼻黏膜中P物質(zhì)mRNA含量較陰性對照siRNA處理組和生理鹽水對照組顯著減少,在鼻黏膜局部SP基因表達(dá)下降達(dá)70％;免疫組化也表明SP-siRNA干預(yù)組鼻黏膜中P物質(zhì)含量明顯降低

10、;小鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀觀測發(fā)現(xiàn)SP-siRNA可明顯改善小鼠鼻炎癥狀;病理學(xué)染色(嗜酸性粒細(xì)胞染色)發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)siRNA干預(yù)后,鼻黏膜中嗜酸性顆粒釋放及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤數(shù)量減少;同時鼻黏膜總蛋白抗體芯片檢測表明,SP-siRNA干預(yù)可顯著減少鼻黏膜局部IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、Eotaxin、Eotaxin-2、CD30L等多種炎性細(xì)胞因子的分泌,而鼻腔給予SP-siRNA并未影響AR模型小鼠血清中IgE含量。說明P物質(zhì)

11、sirNA鼻腔給藥可減輕鼻黏膜局部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)。
　　實驗證明P物質(zhì)siRNA能阻斷變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病過程,SP-siRNA通過抑制肥大細(xì)胞RBL-2H3中P物質(zhì)表達(dá),抑制肥大細(xì)胞脫顆粒反應(yīng),減少多種變應(yīng)性鼻炎相關(guān)炎癥因子的釋放;變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻腔SP-siRNA給藥抑制鼻黏膜局部P物質(zhì)表達(dá)后,可抑制鼻黏膜局部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,減少鼻黏膜局部IL-4、IL-6、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等多種炎癥因子的分泌,抑制鼻黏膜局部變應(yīng)性炎癥反應(yīng)