HmgD過量表達(dá)對(duì)果蠅化蛹及血細(xì)胞發(fā)育影響機(jī)制的研究.pdf

1、果蠅是重要的模式生物，其在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域中有著突出的貢獻(xiàn)。此外，在對(duì)果蠅和人類基因組的比較中發(fā)現(xiàn)，三分之二引發(fā)人類疾病的基因(包括與癌癥有關(guān)的基因)在果蠅中都存在類似的基因。HMGD蛋白最早由Bassuk等從果蠅胚胎細(xì)胞的核中分離得到，是果蠅中最主要的HMG蛋白，由HmgD基因編碼，HmgD基因位于果蠅第二染色體右臂57F10位點(diǎn)。HMGD蛋白含有典型的HMG框結(jié)構(gòu)模式(HMG-box motif)，是哺乳動(dòng)物中H

2、MGB蛋白的同系物。HMGD蛋白分子量小、分布豐度較大，具有染色質(zhì)構(gòu)建因子的功能，參與染色質(zhì)的組裝。HMGD蛋白通過結(jié)合DNA并使之發(fā)生彎曲，為組裝核蛋白復(fù)合物提供方便。此外，HMGD是一種母型蛋白，在卵巢和胚胎發(fā)育的中囊胚過渡之前豐度最大，對(duì)于最初的胚胎發(fā)育非常重要。有研究表明，在果蠅發(fā)育的中囊胚過渡之前，HMGD可以取代H1參與染色質(zhì)的組裝，但HMGD參與形成的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較為疏松，這有利于胚胎發(fā)育早期的快速卵裂。但另有實(shí)驗(yàn)表明，HM

3、GD和Hl沒有相同的結(jié)合DNA的特征，而且HMGD不僅在雌性成體和早期胚胎中表達(dá)，在胚胎發(fā)育的后期以至整個(gè)發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)。因此，HMGD可能不僅僅在果蠅早期胚胎發(fā)育過程中具有參與染色質(zhì)構(gòu)建的功能，很可能在果蠅整個(gè)發(fā)育過程中具有其它重要的尚未可知的功能。 本研究采用LIAS-Gal4系統(tǒng)，通過功能獲得性突變的方法研究了在廣泛表達(dá)的Gal4驅(qū)動(dòng)子(ActGal4)的控制下過量表達(dá)HmgD對(duì)果蠅化蛹及血細(xì)胞發(fā)育影響的分子機(jī)制。結(jié)果表

4、明，HmgD廣泛過量表達(dá)突變體幼蟲在一齡和二齡期發(fā)育正常，而在三齡幼蟲化蛹時(shí)發(fā)育異常，發(fā)育停滯在三齡幼蟲末期至預(yù)蛹的階段，即HmgD過量表達(dá)的幼蟲不能正?；?。采用喂食蛻皮激素的方法，也不能挽救突變表型，說明過量表達(dá) HmgD沒有影響果蠅體內(nèi)蛻皮激素的合成和釋放，而可能是過量表達(dá)HmgD影響了蛻皮激素信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)。分別提取三齡幼蟲中期、后期至預(yù)蛹前的各時(shí)期幼蟲RNA，用RT-PCR的方法檢測(cè)了蛻皮激素受體基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯

5、示，與野生型相比，過量表達(dá)HmgD突變體中三齡幼蟲蛻皮激素受體基因EcR-A、EcR-C的轉(zhuǎn)錄沒有發(fā)生顯著變化，而異構(gòu)體EcR—B卻沒有表達(dá)。表明過量表達(dá) HmgD可能抑制了蛻皮激素受體基因EcR—B，從而導(dǎo)致幼蟲化蛹失敗。EcR-B缺失突變體的發(fā)育缺陷也和本研究系統(tǒng)中的突變幼蟲表型一致，進(jìn)而說明HMGD過量表達(dá)，通過抑制了蛻皮激素受體基因EcR-B的表達(dá)，導(dǎo)致蛻皮激素受體途徑下游基因如E75表達(dá)紊亂，從而引起化蛹失敗。 本研究

6、組前期工作發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)HmgD引起果蠅幼蟲體內(nèi)血細(xì)胞增生，并出現(xiàn)黑色素瘤，為探討HmgD過量表達(dá)導(dǎo)致了血細(xì)胞增生即形成黑色素瘤的分子機(jī)制，本研究分別提取三齡中期、后期和相對(duì)于野生型化蛹前時(shí)刻的幼蟲的RNA，首先檢測(cè)了編碼酚氧化酶(PO)級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵基因．PPAE，Spn27A在突變體中的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Spn27A在三齡中期的表達(dá)量低于野生型，而PPAE的表達(dá)高于野生型，表明過量表達(dá)HmgD影響了酚氧化酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)途

7、徑，低水平的Spn27A不足以抑制PPAE的活性，活化的PPAE催化了PPO的活性，使其轉(zhuǎn)變成有活性的PO，從而促進(jìn)黑色素的生成，使果蠅體內(nèi)產(chǎn)生黑色素瘤。因此我們推測(cè)，HMGD可能參與果蠅的免疫反應(yīng)，這和脊椎動(dòng)物炎癥細(xì)胞中檢測(cè)到高濃度的HMGB1蛋白一致。之后我們又發(fā)現(xiàn)，過量表達(dá)HmgD引起編碼核小體重組因子NURF催化亞單位ISWI基因高表達(dá)，編碼細(xì)胞周期蛋白A、E的基因cyclinA、cyclinE高表達(dá)?？赡苓@些途徑相互作用，導(dǎo)致