過(guò)量表達(dá)OsiICK4對(duì)水稻種子發(fā)育及植株生長(zhǎng)的影響.pdf

1、細(xì)胞分裂及其周而復(fù)始的循環(huán)是植物(包括其它生物)生長(zhǎng)發(fā)育的基本動(dòng)力。正常的細(xì)胞周期，即從上一次分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為止的活動(dòng)過(guò)程，是由一種高度保守的分子機(jī)制調(diào)控。細(xì)胞周期依賴激酶抑制因子(InhibitorsofCDK，ICKs)即是這種分子調(diào)控機(jī)制中重要的一環(huán)。在水稻上，根據(jù)基因組序列預(yù)測(cè)的ICK基因共有6個(gè)，除了Oryza；ICK1(克隆自粳稻)和OsiICK6(克隆自秈稻)之外，其它ICK基因的功能尚未得到驗(yàn)證。本研究選擇其中

2、一個(gè)編碼產(chǎn)物最短的OsiICK4進(jìn)行分子特征和過(guò)表達(dá)分析，并進(jìn)而觀察它對(duì)水稻植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響。所用的啟動(dòng)子為本實(shí)驗(yàn)室自己克隆的水稻33kDa分泌蛋白啟動(dòng)子(33kDasecretary protein promoter，33SP)，所用的遺傳轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化法。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 利用RT-PCR法克隆得到的OsiICK4序列全長(zhǎng)為261bp，編碼85個(gè)氨基酸。MEME分析顯示OsiICK4C-末端含

3、有2個(gè)保守區(qū)域，為典型的植物ICKs的CDK和CYC結(jié)合功能域，進(jìn)一步的分析表明，OsiICK4還含有一個(gè)推定的核定位信號(hào)。但與水稻其它ICKs不同的是，OsiICK4沒(méi)有PEST功能域和CDK磷酸化位點(diǎn)；
　　 亞細(xì)胞定位結(jié)果表明OsiICK4是核蛋白，利用酵母雙雜交分析證實(shí)它能與OsiCDKA和OsiCYCD蛋白相互作用，但不能與OsiCDKB蛋白互作；
　　 遺傳轉(zhuǎn)化共獲得23個(gè)過(guò)量表達(dá)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體，對(duì)其中4個(gè)轉(zhuǎn)化體

4、的T2代純系的半定量RT-PCR分析顯示，OsiICK4的表達(dá)量都顯著高于對(duì)照。進(jìn)一步的表型分析表明，所獲得的T2代純系比對(duì)照植株平均矮20％左右。根據(jù)顯微切片數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其原因是轉(zhuǎn)基因植株莖桿細(xì)胞的長(zhǎng)度明顯增加，但是其相應(yīng)的細(xì)胞數(shù)量卻大為減少；
　　 OsiICK4基因的過(guò)量表達(dá)還導(dǎo)致葉片異常反卷。同樣的由顯微切片觀察發(fā)現(xiàn)，這種葉片異常反卷是由于OsiICK4基因的過(guò)量表達(dá)引起葉片的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞數(shù)量減少，但其體積明顯增大所至。上述結(jié)果

5、表明，過(guò)量表達(dá)OsiICK4能有效抑制細(xì)胞分裂，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少，但以細(xì)胞體積增大作為補(bǔ)償。
　　 OsiICK4基因的過(guò)量表達(dá)還導(dǎo)致水稻花粉育性降低和種子發(fā)育異常，以至終產(chǎn)量大幅減少?；ǚ塾詸z測(cè)和細(xì)胞核DAPI染色結(jié)果顯示，過(guò)量表達(dá)植株的花粉大多數(shù)染色淺或不染色，并停留在單核期，因此，植株高度不育性，即便產(chǎn)生少量種子，但胚乳充實(shí)不完全，部分胚消亡。上述結(jié)果表明，OsiICK4基因在花粉的形成和胚及胚乳發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮十分重要的