過量atRA對胎鼠腭間充質(zhì)細胞增殖的影響及作用機制.pdf

1、目的:
　　探討過量全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，atRA）小鼠腭間充質(zhì)細胞增殖的影響及其作用機制。
　　方法:
　　取周齡為10周左右的SPF級C57BL/6J近交系小鼠(雌鼠40只，雄鼠20只)，于前一天晚8時按雌雄比2:1進行合籠交配。以次日早晨觀察到陰栓陽性的雌鼠標記為妊娠0天(gestation day0, GD0)，共獲得30只孕鼠，隨機分組后，每組15只。在GD10時，實驗

2、組以一次性灌胃給藥的方式給予孕鼠100mg/kg的atRA，對照組孕鼠灌以等量玉米油。分別取兩組GD13、14、15和16時灌胃時點的胎鼠標本，利用HE染色連續(xù)觀察胎鼠腭板發(fā)育情況。
　　我們建立GD13胎鼠腭突間充質(zhì)細胞原代培養(yǎng)模型，利用生長狀態(tài)較好的第三代胎鼠腭間充質(zhì)(mouse embryonic palate mesenchymal, MEPM)細胞進行體外實驗，根據(jù)atRA作用濃度，實驗共分為5組(0.1μmol/L、0

3、.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)，并設(shè)空白對照組。atRA作用時間分別為：24h、48h和72h。利用臺盼藍染色、MTT法檢測atRA對MEPM細胞活性的時間-效應(yīng)和劑量-效應(yīng)關(guān)系，由此結(jié)合 RA的臨床藥理特點，選擇適宜的時間和濃度，進行后續(xù)的實驗。利用Real-time PCR檢測過量atRA對Smad2、Smad7 mRNA表達的影響， Western blot方法檢測過量atRA對MEPM細胞內(nèi)

4、蛋白Smad2、Smda7和p-Smad2蛋白表達的影響。應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS17.0分析本實驗結(jié)果。檢驗水準均為雙側(cè)α=0.05。
　　結(jié)果:
　　HE染色實驗結(jié)果顯示：對照組GD13、14、15和16胎鼠雙側(cè)腭板完成上抬、接觸及融合過程；而與對照組相比，實驗組 GD13胎鼠雙側(cè)腭板體積較小，且并未觀察到雙側(cè)腭板上抬；GD14時，實驗組胎鼠雙側(cè)腭板未上抬，可觀察到發(fā)育明顯延遲；GD15時，實驗組雙側(cè)腭板仍未發(fā)生接觸，最終在

5、GD16時觀察到實驗組胎鼠兩側(cè)腭板形成腭裂。
　　臺盼藍染色結(jié)果顯示，隨atRA作用時間及濃度增加細胞拒染率逐漸降低，提示隨atRA作用時間及濃度增加，細胞活性逐漸下降；MTT實驗結(jié)果顯示：atRA濃度在0.1-10μmol/L范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間延長，MEPM細胞吸光度值為遞減趨勢，MEPM細胞活性隨著atRA濃度增加細胞活性逐漸下降，尤其是加藥72小時后，細胞增殖明顯受到抑制，并呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。我們利用SPSS17.0分

6、析得到atRA作用72小時對MEPM細胞的半數(shù)抑制濃度為：4.76μmol/L。實時定量Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組比，實驗組(5μmol/L atRA)可促進Smad7 mRNA的表達(P<0.05)，而對Smad2 mRNA表達無影響(P>0.05)；Western blot實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，5μmol/L atRA可下調(diào) p-Smad2蛋白的表達，促進Smad7蛋白表達，但對Smad2蛋白表達并無影響(P