山楂矢車菊素-3-O-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因篩選、克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、花色苷是廣泛分布于自然界的一種水溶性植物色素，具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、防治心血管疾病等多種生物活性[1-3]。花色苷易受光照、溫度、pH值影響[4]，分離純化花色苷單體比較困難，導(dǎo)致花色苷對(duì)照品市場(chǎng)售價(jià)極高;還有些種類的花色苷由于在植物中含量極低，無法通過化學(xué)分離的手段得到。生物合成技術(shù)為大量獲得有效成分提供了新的思路，近年來有關(guān)花色苷生物合成與調(diào)控機(jī)制的研究已在玉米、擬南芥、葡萄、蘋果等植物中取得了進(jìn)展[5]。山楂（山里紅Crat

2、aegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.或山楂C pinnatifida Bge.）是傳統(tǒng)中藥，近年來常用于心血管疾病的治療，其藥效與山楂中所含的黃酮類成分密切相關(guān)。課題組前期研究表明，山楂果實(shí)中花色苷類成分主要為矢車菊素-3-O-半乳糖苷（Cyanidin-3-O-galactoside，Cy-3-O-Gal）和矢車菊素-3-O-阿拉伯糖苷[6]，且這兩種成分含量低，單體的提取分離比較困難。

3、>　　本研究擬將化學(xué)分析和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)山楂中花色苷類成分進(jìn)行研究，旨在獲得山楂果實(shí)花色苷生物合成的關(guān)鍵酶及其編碼基因，為通過生物合成的手段獲得花色苷類成分奠定基礎(chǔ)。
　　研究?jī)?nèi)容主要分為4個(gè)部分。
　　第一章為文獻(xiàn)綜述
　　一方面，對(duì)山楂化學(xué)成分及成分分析方面的報(bào)道進(jìn)行分析整理，為開展不同發(fā)育期山楂果實(shí)有效成分變化規(guī)律提供了技術(shù)參考;另一方面，綜述了花色苷類成分提取分離、成分分析、藥效活性以及生物合成等方面

4、的研究，研究表明花色苷類成分有良好的藥效活性及應(yīng)用價(jià)值，僅依靠化學(xué)分離技術(shù)已不能滿足花色苷的應(yīng)用需求，急需一種高效的獲得花色苷類成分的方法;另外，有關(guān)花色苷類成分生物合成方面的研究已經(jīng)有大量的研究基礎(chǔ)，為今后開展山楂果實(shí)花色苷類成分的合成生物學(xué)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　第二章為不同發(fā)育期山楂果實(shí)有效成分含量變化規(guī)律研究采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)山楂樣品制備方法進(jìn)行優(yōu)化，建立了山楂果實(shí)中表兒茶素、原花青素B2(Procyanidin B2

5、，PC B2)、金絲桃苷、異槲皮苷、綠原酸、熊果酸、Cy-3-O-Gal7種化學(xué)成分的含量測(cè)定方法，并對(duì)不同發(fā)育期山楂果實(shí)中這7種成分進(jìn)行了含量測(cè)定。結(jié)果表明，在山楂果實(shí)發(fā)育過程中表兒茶素、PCB2、金絲桃苷、異槲皮苷、綠原酸、熊果酸、Cy-3-O-Gal含量（干燥重量，Drymass，DM)變化范圍分別為4.932～19.315mg/g、2.218～14.549mg/g、0.066～0.184mg/g、0.053～0.117mg/g、

6、0.532～1.834mg/g、2.163～5.942mg/g、0.005～0.188mg/g?；ㄉ蘸吭诠麑?shí)即將成熟時(shí)迅速增加，在成熟時(shí)達(dá)到最大值，表兒茶素和PCB2則與花色苷變化趨勢(shì)不同，在果實(shí)趨向成熟的階段其含量逐漸減少。
　　第三章為山楂果實(shí)花色苷生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的篩選
　　本研究以不同發(fā)育期山楂果實(shí)為研究材料，以改良CTAB法提取山楂果實(shí)總RNA，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，同時(shí)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real

7、-timequantitative PCR, RT-PCR)，對(duì)花色苷生物合成途徑12個(gè)基因家族的28個(gè)基因在山楂果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示Cp4CL2、Cp4CL3、Cp4CL4、Cp4CL5、CpCH1、CpCHI、CpCHI3、CpF3H1、CpF3'5'H1、CpF3'5'H2、CpF3'5'H、CpF3'5'H、CpF3'5'H、CpLDOX1和Cp3OGT基因與花色苷成分有顯著的正向相關(guān)關(guān)系，預(yù)示著上述基因可

8、能是參與山楂果實(shí)花色苷生物合成的關(guān)鍵酶基因，為花色苷的生物合成提供了參考資料。
　　第四章為山楂果實(shí)Cp3OGT基因的克隆和功能分析
　　本研究從山楂果實(shí)轉(zhuǎn)錄組中獲得Cp3OGT基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，克隆該基因全長cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及基因表達(dá)模式分析。結(jié)果表明，Cp3OGT基因完整的ORF開放閱讀框位于38-1486 bp，編碼482 aa的蛋白質(zhì)，分子量約為52 KDa;該蛋白具有“UDPGT”的結(jié)

9、構(gòu)功能域，基因表達(dá)分析表明Cy-3-O-Gal含量與Cp3OGT基因相對(duì)表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.8513。為了驗(yàn)證其功能，將重組的pET28a-Cp3OGT載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行原核表達(dá)，采用經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒定正確的蛋白用于體外酶促反應(yīng)。然后采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，通過比對(duì)保留時(shí)間和離子對(duì)數(shù)據(jù)，明確酶促反應(yīng)產(chǎn)物為Cy-3-O-Gal，表明Cp3OGT蛋白具有催化矢車菊素合成Cy-3-O-Gal的活性。