β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的純化及活性測(cè)定.pdf

1、β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(β4GTase)家族是一類在高爾基體上專一性負(fù)責(zé)合成β→1，4糖苷鍵，以對(duì)蛋白質(zhì)，特別是膜蛋白進(jìn)行糖鏈修飾的蛋白酶。此外，β4GTase還充當(dāng)細(xì)胞膜的識(shí)別因子，參與精卵結(jié)合、細(xì)胞的生長(zhǎng)與遷移、內(nèi)分泌等過程及自體免疫性疾病調(diào)控等。本文就β4GTase的基因家族組成、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能、體內(nèi)定位、測(cè)定方法及其生物學(xué)功能等研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)述。　　目前，對(duì)于大部分的β4GTase表達(dá)系統(tǒng)，由于受到各種因素的限制，仍無(wú)

2、法獲得大量的高效β4GTase蛋白，這給對(duì)β4GTase的進(jìn)一步研究帶來(lái)了很大困難。Gong等人建立了以E.coliDH5α菌株為宿主菌的小鼠β4GTase融合表達(dá)系統(tǒng)。本研究將對(duì)上述表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行再優(yōu)化，并對(duì)融合蛋白酶切、純化，并對(duì)獲得的重組目的蛋白進(jìn)行酶活、催化特征等進(jìn)行系列分析。　　本實(shí)驗(yàn)首先抽提質(zhì)粒pGEX-4T-2-β4GTase，而后將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入另一E.coli菌株BL21(DE3)pLysS，因后者含有質(zhì)粒plysS，有助

3、于降低宿主細(xì)胞原有蛋白的表達(dá)水平，從而提高融合蛋白的表達(dá)效率。對(duì)大量誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行裂解，離心，用谷胱甘肽Sepharose4B親和柱對(duì)上清進(jìn)行親和純化，獲得融合蛋白；用凝血酶對(duì)純化后的融合蛋白進(jìn)行酶切，以SephadexG-100柱分離酶切后的混合體系，獲得重組目的蛋白β4GTase。最終產(chǎn)率為20mg蛋白/1L培養(yǎng)基。然后，利用pH依賴的苯酚紅測(cè)定法繪制測(cè)定體系的光密度-H+濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，配合重組蛋白催化反應(yīng)的光密度-時(shí)間曲線，計(jì)