桃兒七離體培養(yǎng)體系的建立與發(fā)狀根誘導(dǎo)研究.pdf

1、桃兒七（Sinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying）是小檗科（Berberidaceae）鬼臼亞科（Podophylloideae）桃兒七屬多年生草本植物。其根和根莖中含有的鬼臼毒素，是合成抗癌藥物的重要原料來源。隨著人們生活水平與質(zhì)量的不斷提高，對(duì)抗癌藥物的需求也日益增大，對(duì)桃兒七資源的需求量也不斷增加。由于桃兒七生長(zhǎng)緩慢、對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求高、分布區(qū)域狹小，野生資源稀缺，導(dǎo)致市場(chǎng)緊俏。加之近年來大量人工挖掘

2、以及人工栽培困難，使桃兒七資源面臨瀕危境地，目前已被列入《中國(guó)珍稀瀕危植物名錄》，國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物。因此，利用植物細(xì)胞工程技術(shù)的原理與方法，人工繁殖桃兒七并進(jìn)行“鬼臼毒素”的工業(yè)化生產(chǎn)，具有重要的理論與實(shí)踐意義，被普遍認(rèn)為是一條有效保護(hù)與利用桃兒七這一瀕危稀缺資源，緩解“鬼臼毒素”市場(chǎng)需求的一條重要的新途徑。本實(shí)驗(yàn)以桃兒七種胚為材料，通過對(duì)無菌苗誘導(dǎo)及培養(yǎng)方法的優(yōu)化，建立了高效、穩(wěn)定的種胚培養(yǎng)體系，并以桃兒七種胚和抱窩磷莖為受體，利用發(fā)

3、根農(nóng)桿菌2100轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)毛狀根研究，以期建立桃兒七毛狀根培養(yǎng)體系和篩選高含量“鬼臼毒素”培養(yǎng)系的研究。主要取得如下研究結(jié)果：
　　 ⑴桃兒七種胚離體培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基MS+IAA0.5mg/L+KT0.2mg/L+GA30.3mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)到98.34％。22℃低溫和全天候光照最適于桃兒七無菌苗的誘導(dǎo)，有效降低褐化率。繼代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基MS+對(duì)苯二酚0.5mg/I+AC0.5 mg/l，抱窩鱗莖增多，根逐漸生長(zhǎng)變粗，有效解決了無

4、菌苗細(xì)弱，生根難的問題。1-5mg/L對(duì)苯二酚與0.5mg/LAC對(duì)桃兒七無菌苗生根培養(yǎng)具有明顯促進(jìn)作用。添加適宜濃度的AC明顯降低種胚的褐化率，有效提高誘導(dǎo)率；創(chuàng)造的黑暗環(huán)境有利于根的誘導(dǎo)和根系的生長(zhǎng)。
　　 ⑵本實(shí)驗(yàn)歷時(shí)一年，以發(fā)根農(nóng)桿菌R1000與2100為轉(zhuǎn)化菌株，對(duì)轉(zhuǎn)化受體、培養(yǎng)條件、轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行多次對(duì)比調(diào)試，每種處理接種80粒，進(jìn)行4次重復(fù)，最終以種胚為感染受體，預(yù)培養(yǎng)1天，用發(fā)根農(nóng)桿菌2100菌液OD600值在0.

5、2-0.4之間侵染15分鐘，共培養(yǎng)1天，500mg/Lcef進(jìn)行脫菌培養(yǎng)，侵染獲得毛狀根均在此條件下獲得。光照有利于桃兒七毛狀根的誘導(dǎo)，黑暗條件下轉(zhuǎn)化的外植體均未誘導(dǎo)出毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌2100轉(zhuǎn)化桃兒七獲得毛狀根無向地性但生長(zhǎng)緩慢，無多分枝，并不完全具備毛狀根的典型特征，且誘導(dǎo)率極低，無法進(jìn)行PER檢測(cè)，不能確定即為發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所得毛狀根。
　　 ⑶為證實(shí)桃兒七發(fā)狀根誘導(dǎo)的困難和驗(yàn)證所采用的轉(zhuǎn)化方法的可靠性，用發(fā)根農(nóng)桿菌21

6、00對(duì)葡萄單芽莖段進(jìn)行對(duì)照誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，在莖段的基部產(chǎn)生了大量的毛狀根系，呈黃白色，無向地性、多分枝、生長(zhǎng)迅速等特點(diǎn)，具備毛狀根的典型特征。經(jīng)PCR檢測(cè)，發(fā)根農(nóng)桿菌含有的RiT-DNA的ro1C發(fā)根基因已整合進(jìn)入葡萄基因組中，證明本實(shí)驗(yàn)所采用的毛狀根誘導(dǎo)菌株與轉(zhuǎn)化方法可行。
　　 ⑷鑒于桃兒七鬼臼毒素工業(yè)化生產(chǎn)的必要性，有必要繼續(xù)深入發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)桃兒七遺傳轉(zhuǎn)化的研究。下一步工作可以考慮通過物理化學(xué)的方法對(duì)轉(zhuǎn)化外植體進(jìn)行處理，提高其對(duì)