外排泵MexAB-OprM在銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM高表達(dá)的研究
　　目的：外排泵系統(tǒng)是多重耐藥銅綠假單胞菌的重要耐藥機(jī)制之一。MexAB-OprM外排泵是銅綠假單胞菌中對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的外排泵系統(tǒng)，mexR、nalC和nalD是MexAB-OprM外排泵的調(diào)控基因。本研究是為了解MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem?resistant Pseudomonas ae

2、ruginosa，CRPA）中的表達(dá)情況，以及調(diào)控基因mexR, nalC和nalD的突變對外排泵基因mexA表達(dá)量的影響。
　　方法：篩選收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年～2012年微生物室分離的碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌。采用微量肉湯稀釋法檢測篩選出的銅綠假單胞菌耐藥株對亞胺培南和美羅培南的MIC（Minimal inhibitory concentration，最低抑菌濃度），并進(jìn)行外排泵表型篩選試驗(yàn)。Carb

3、a NP試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)分別用來檢測外排泵篩選陽性菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶和金屬酶。采用Real-time PCR檢測外排泵表型陽性的CRPA外排泵融合基因mexA的mRNA表達(dá)水平。同時(shí)利用普通PCR擴(kuò)增外排泵陽性菌株的外排泵基因mexB和調(diào)控基因mexR, nalC, nalD以及外膜蛋白OprD2基因，所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序并比對。
　　結(jié)果：75株CRPA菌株，有13株（17.3%）外排泵表型篩選試驗(yàn)陽性。這13株CRP

4、A菌株的Carba NP試驗(yàn)和EDTA協(xié)同試驗(yàn)的結(jié)果均為陰性。PCR結(jié)果顯示，13株外排泵表型陽性的銅綠假單胞菌中，有10株mexB基因陽性，且其外排泵調(diào)控基因mexR, nalC, nalD均為陽性。PCR產(chǎn)物測序比對結(jié)果顯示，有9株CRPA的NalC發(fā)生第71位氨基酸的點(diǎn)突變Gly→ Glu，其中8株CRPA同時(shí)還發(fā)生第209為氨基酸的點(diǎn)突變Ser→ Arg；僅有1株CRPA發(fā)生NalD第158位氨基酸突變Thr→Ile。有8株CR

5、PA發(fā)生MexR的點(diǎn)突變。
　　結(jié)論:MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌起著至關(guān)重要的作用。外排泵調(diào)控基因的點(diǎn)突變或許是導(dǎo)致外排泵MexAB-OprM高表達(dá)的原因之一。
　　第二部分 MexAB-OprM系統(tǒng)在銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥的作用研究
　　目的：銅綠假單胞菌是臨床上重要的條件致病菌，由于其對碳青霉烯類抗生素的耐藥性越來越高，因此對其耐藥機(jī)制的研究越來越受到重視。MexAB-OprM是

6、銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的外排泵系統(tǒng)，特別是其對美羅培南耐藥十分相關(guān)，但一直認(rèn)為其對亞胺培南的耐藥無作用。本研究針對一株外排泵抑制劑對亞胺培南有效而對美羅培南無效的銅綠假單胞菌，利用同源重組技術(shù)敲除外排泵MexAB-OprM的融合蛋白基因mexA，以研究外排泵MexAB-OprM對亞胺培南耐藥的作用。
　　方法：利用細(xì)菌體內(nèi)廣泛存在RecBCD系統(tǒng)對外源進(jìn)入的DNA進(jìn)行同源重組，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的等位替換。首先采用

7、PCR擴(kuò)增得到mexA基因的上、下游同源臂A、B片段，再用交疊PCR擴(kuò)增得到mexA基因上下游同源臂的融合AB片段，此AB片段中間已缺失目標(biāo)基因mexA。自殺載體pLP12為T線性化載體，可直接與純化PCR產(chǎn)物連接，將目標(biāo)基因的融合AB片段與自殺載體pLP12T連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5αλpir感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)pLP-UF/pLP-UR篩選AB插入的克隆，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒pLP12-mexA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌β2163。大腸桿菌

8、β2163具有高效的接合效應(yīng)，且其由于缺陷型，只能在含DAP（Diaminopimelic acid）的培養(yǎng)基中生長。將自殺載體連接產(chǎn)物pLP12-mexA通過接合輸入到靶細(xì)菌中，培養(yǎng)后菌液涂布LB平板（Cm=200μg/ml）。由于自殺載體不能在細(xì)菌中復(fù)制，在抗生素選擇（Cm）壓力下，只有整合有自殺載體的插入突變株才可以存活（發(fā)生第一次同源重組）。挑取陽性克隆，涂布含L-阿拉伯糖的LB平板上，L-阿拉伯糖能誘導(dǎo)自殺載體毒性基因的表達(dá)，

9、在第二輪反向選擇壓力下，只有細(xì)菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失自殺質(zhì)粒的細(xì)菌才可以存活。第二組同源重組后，子代細(xì)菌產(chǎn)生靶基因的缺失突變株和野生型菌株，通過PCR克隆篩選后將PCR產(chǎn)物直接測序，確認(rèn)mexA缺失突變株的構(gòu)建成功。將mexA基因敲除后的菌株進(jìn)行Real-time PCR驗(yàn)證mexA的相對表達(dá)量，以及進(jìn)行亞胺培南的藥敏試驗(yàn)。
　　結(jié)果：分別以mexA上下游同源臂的引物PCR擴(kuò)增得到上下游同源臂A、B片段，其片段長度分別為

10、618bp、416bp。以A、B片段為模板，進(jìn)行交疊PCR得到AB融合片段，長度為993bp。將AB融合片段與自殺載體pLP12T連接，用載體的引物進(jìn)行 PCR驗(yàn)證，篩選得到 AB插入的克隆（pLP12-mexA），連接成功的載體片段的長度明顯長于未連接成功的載體。將連接成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到供體菌大腸桿菌β2163，在其高接合效率下成功將質(zhì)粒（pLP12-mexA）輸入到原始的銅綠假單胞菌（野生型）中去。同時(shí)，由于細(xì)菌胞內(nèi)重組酶的存在，接合

11、的同時(shí)也在發(fā)生基因相似片段的同源重組。在抗生素選擇（Cm）壓力下，只有質(zhì)粒插入到染色體指定位點(diǎn)的銅綠假單胞菌能存活，挑取陽性克隆并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，野生株只產(chǎn)生一個(gè)擴(kuò)增片段，插入突變形成兩個(gè)擴(kuò)增條帶。插入突變株進(jìn)一步涂布于含 L-阿拉伯糖的 LB培養(yǎng)基上，由于 L-阿拉伯糖能誘導(dǎo)反向選擇標(biāo)記基因的毒性作用，在第二輪反向選擇壓力下，只有細(xì)菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失自殺質(zhì)粒的細(xì)菌才可以存活，子代細(xì)菌產(chǎn)生靶基因的缺失突變株和野生型菌株。通

12、過PCR篩選，缺失突變克隆擴(kuò)增片段產(chǎn)生1403bp片段，野生型擴(kuò)增片段長2159bp。將缺失突變克隆菌株純化培養(yǎng)后再次擴(kuò)增驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物測序，確認(rèn)mexA缺失突變株構(gòu)建成功。mexA基因敲除后mexA相對表達(dá)量幾乎下降至0（22.63→0.00014），該結(jié)果進(jìn)一步證明了mexA基因被敲除。對mexA基因敲除前后菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其敲除后銅綠假單胞菌對亞胺培南的MIC明顯下降（32μg/ml→4μg/ml）。
　　結(jié)論：利用同源

13、重組的技術(shù)原理，采用線性化自殺載體pLP12T成功的將銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的mexA基因敲除。敲除后菌株對亞胺培南的耐藥性明顯下降，提示外排泵MexAB-OprM參與了亞胺培南耐藥性的形成。
　　第三部分利用RNA-seq研究銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機(jī)制
　　目的：銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥機(jī)制不盡相同。為了更全面的了解銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機(jī)制，從而進(jìn)行本部分研究。
　　方法：

14、利用RNA-seq技術(shù)對AB菌株進(jìn)行高通量測序，分析比較二者的差異基因，來研究和探討銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機(jī)制。
　　結(jié)果：A,B菌株各做三個(gè)重復(fù)樣本，進(jìn)行細(xì)菌總RNA的提取，其RNA的質(zhì)檢結(jié)果均合格。對RNA-seq測序數(shù)據(jù)的結(jié)果進(jìn)行一系列的檢測和評估，說明測序質(zhì)量較好，可以進(jìn)行數(shù)據(jù)的比對分析。差異基因的篩選結(jié)果中，銅綠假單胞菌 IPMS株（sample A）與IPMR（sample B）相比，共有差異表達(dá)的基因630個(gè)，

15、其中297個(gè)基因明顯上調(diào)，333個(gè)基因明顯下調(diào)。其中與耐藥基因相關(guān)的差異基因共有29個(gè)，其中15個(gè)基因明顯上調(diào)，14個(gè)基因明顯下調(diào)。差異基因GO富集，共有162條GO功能注釋，其中顯著富集（P<0.05）的結(jié)果共7條，差異基因經(jīng)過KEGG富集分析，共得到83條信號通路的功能注釋，有4條通過KEGG顯著富集，其中耐藥相關(guān)通路中包括有9個(gè)基因。
　　結(jié)論：通過RNA-seq測序結(jié)果中差異基因的研究，銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機(jī)制