外排泵MexAB-OprM在銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥機制的研究.pdf

1、第一部分碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM高表達的研究
　　目的：外排泵系統(tǒng)是多重耐藥銅綠假單胞菌的重要耐藥機制之一。MexAB-OprM外排泵是銅綠假單胞菌中對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的外排泵系統(tǒng)，mexR、nalC和nalD是MexAB-OprM外排泵的調控基因。本研究是為了解MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌（carbapenem?resistant Pseudomonas ae

2、ruginosa，CRPA）中的表達情況，以及調控基因mexR, nalC和nalD的突變對外排泵基因mexA表達量的影響。
　　方法：篩選收集安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2011年～2012年微生物室分離的碳青霉烯類抗生素耐藥的銅綠假單胞菌。采用微量肉湯稀釋法檢測篩選出的銅綠假單胞菌耐藥株對亞胺培南和美羅培南的MIC（Minimal inhibitory concentration，最低抑菌濃度），并進行外排泵表型篩選試驗。Carb

3、a NP試驗和EDTA協(xié)同試驗分別用來檢測外排泵篩選陽性菌株是否產(chǎn)碳青霉烯酶和金屬酶。采用Real-time PCR檢測外排泵表型陽性的CRPA外排泵融合基因mexA的mRNA表達水平。同時利用普通PCR擴增外排泵陽性菌株的外排泵基因mexB和調控基因mexR, nalC, nalD以及外膜蛋白OprD2基因，所得PCR產(chǎn)物進行測序并比對。
　　結果：75株CRPA菌株，有13株（17.3%）外排泵表型篩選試驗陽性。這13株CRP

4、A菌株的Carba NP試驗和EDTA協(xié)同試驗的結果均為陰性。PCR結果顯示，13株外排泵表型陽性的銅綠假單胞菌中，有10株mexB基因陽性，且其外排泵調控基因mexR, nalC, nalD均為陽性。PCR產(chǎn)物測序比對結果顯示，有9株CRPA的NalC發(fā)生第71位氨基酸的點突變Gly→ Glu，其中8株CRPA同時還發(fā)生第209為氨基酸的點突變Ser→ Arg；僅有1株CRPA發(fā)生NalD第158位氨基酸突變Thr→Ile。有8株CR

5、PA發(fā)生MexR的點突變。
　　結論:MexAB-OprM外排泵在碳青霉烯類抗生素耐藥銅綠假單胞菌起著至關重要的作用。外排泵調控基因的點突變或許是導致外排泵MexAB-OprM高表達的原因之一。
　　第二部分 MexAB-OprM系統(tǒng)在銅綠假單胞菌亞胺培南耐藥的作用研究
　　目的：銅綠假單胞菌是臨床上重要的條件致病菌，由于其對碳青霉烯類抗生素的耐藥性越來越高，因此對其耐藥機制的研究越來越受到重視。MexAB-OprM是

6、銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素耐藥最主要的外排泵系統(tǒng)，特別是其對美羅培南耐藥十分相關，但一直認為其對亞胺培南的耐藥無作用。本研究針對一株外排泵抑制劑對亞胺培南有效而對美羅培南無效的銅綠假單胞菌，利用同源重組技術敲除外排泵MexAB-OprM的融合蛋白基因mexA，以研究外排泵MexAB-OprM對亞胺培南耐藥的作用。
　　方法：利用細菌體內廣泛存在RecBCD系統(tǒng)對外源進入的DNA進行同源重組，從而實現(xiàn)目標基因的等位替換。首先采用

7、PCR擴增得到mexA基因的上、下游同源臂A、B片段，再用交疊PCR擴增得到mexA基因上下游同源臂的融合AB片段，此AB片段中間已缺失目標基因mexA。自殺載體pLP12為T線性化載體，可直接與純化PCR產(chǎn)物連接，將目標基因的融合AB片段與自殺載體pLP12T連接。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5αλpir感受態(tài)細胞，經(jīng)pLP-UF/pLP-UR篩選AB插入的克隆，挑取陽性克隆，提取質粒pLP12-mexA，轉化大腸桿菌β2163。大腸桿菌

8、β2163具有高效的接合效應，且其由于缺陷型，只能在含DAP（Diaminopimelic acid）的培養(yǎng)基中生長。將自殺載體連接產(chǎn)物pLP12-mexA通過接合輸入到靶細菌中，培養(yǎng)后菌液涂布LB平板（Cm=200μg/ml）。由于自殺載體不能在細菌中復制，在抗生素選擇（Cm）壓力下，只有整合有自殺載體的插入突變株才可以存活（發(fā)生第一次同源重組）。挑取陽性克隆，涂布含L-阿拉伯糖的LB平板上，L-阿拉伯糖能誘導自殺載體毒性基因的表達，

9、在第二輪反向選擇壓力下，只有細菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失自殺質粒的細菌才可以存活。第二組同源重組后，子代細菌產(chǎn)生靶基因的缺失突變株和野生型菌株，通過PCR克隆篩選后將PCR產(chǎn)物直接測序，確認mexA缺失突變株的構建成功。將mexA基因敲除后的菌株進行Real-time PCR驗證mexA的相對表達量，以及進行亞胺培南的藥敏試驗。
　　結果：分別以mexA上下游同源臂的引物PCR擴增得到上下游同源臂A、B片段，其片段長度分別為

10、618bp、416bp。以A、B片段為模板，進行交疊PCR得到AB融合片段，長度為993bp。將AB融合片段與自殺載體pLP12T連接，用載體的引物進行 PCR驗證，篩選得到 AB插入的克?。╬LP12-mexA），連接成功的載體片段的長度明顯長于未連接成功的載體。將連接成功的質粒轉化到供體菌大腸桿菌β2163，在其高接合效率下成功將質粒（pLP12-mexA）輸入到原始的銅綠假單胞菌（野生型）中去。同時，由于細菌胞內重組酶的存在，接合

11、的同時也在發(fā)生基因相似片段的同源重組。在抗生素選擇（Cm）壓力下，只有質粒插入到染色體指定位點的銅綠假單胞菌能存活，挑取陽性克隆并進行PCR驗證，野生株只產(chǎn)生一個擴增片段，插入突變形成兩個擴增條帶。插入突變株進一步涂布于含 L-阿拉伯糖的 LB培養(yǎng)基上，由于 L-阿拉伯糖能誘導反向選擇標記基因的毒性作用，在第二輪反向選擇壓力下，只有細菌基因組發(fā)生第二次同源重組并丟失自殺質粒的細菌才可以存活，子代細菌產(chǎn)生靶基因的缺失突變株和野生型菌株。通

12、過PCR篩選，缺失突變克隆擴增片段產(chǎn)生1403bp片段，野生型擴增片段長2159bp。將缺失突變克隆菌株純化培養(yǎng)后再次擴增驗證，PCR產(chǎn)物測序，確認mexA缺失突變株構建成功。mexA基因敲除后mexA相對表達量幾乎下降至0（22.63→0.00014），該結果進一步證明了mexA基因被敲除。對mexA基因敲除前后菌株進行藥敏試驗，其敲除后銅綠假單胞菌對亞胺培南的MIC明顯下降（32μg/ml→4μg/ml）。
　　結論：利用同源

13、重組的技術原理，采用線性化自殺載體pLP12T成功的將銅綠假單胞菌外排泵MexAB-OprM的mexA基因敲除。敲除后菌株對亞胺培南的耐藥性明顯下降，提示外排泵MexAB-OprM參與了亞胺培南耐藥性的形成。
　　第三部分利用RNA-seq研究銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制
　　目的：銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥機制不盡相同。為了更全面的了解銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制，從而進行本部分研究。
　　方法：

14、利用RNA-seq技術對AB菌株進行高通量測序，分析比較二者的差異基因，來研究和探討銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機制。
　　結果：A,B菌株各做三個重復樣本，進行細菌總RNA的提取，其RNA的質檢結果均合格。對RNA-seq測序數(shù)據(jù)的結果進行一系列的檢測和評估，說明測序質量較好，可以進行數(shù)據(jù)的比對分析。差異基因的篩選結果中，銅綠假單胞菌 IPMS株（sample A）與IPMR（sample B）相比，共有差異表達的基因630個，

15、其中297個基因明顯上調，333個基因明顯下調。其中與耐藥基因相關的差異基因共有29個，其中15個基因明顯上調，14個基因明顯下調。差異基因GO富集，共有162條GO功能注釋，其中顯著富集（P<0.05）的結果共7條，差異基因經(jīng)過KEGG富集分析，共得到83條信號通路的功能注釋，有4條通過KEGG顯著富集，其中耐藥相關通路中包括有9個基因。
　　結論：通過RNA-seq測序結果中差異基因的研究，銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機制