耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究.pdf

1、第一部分銅綠假單胞菌藥物敏感性試驗(yàn)及同源性分析
　　 銅綠假單胞菌(PA)是醫(yī)院感染的主要病原菌之一,引起臨床多種感染。本課題對(duì)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院2005年1月至2005年12月一年間臨床分離的141株耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌進(jìn)行了研究。
　　 瓊脂稀釋法測(cè)定141株耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌菌株對(duì)14種抗菌藥物的敏感性,結(jié)果顯示其中有141株耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南和美羅培南耐藥(MIC≥16μg/ml)。藥

2、敏試驗(yàn)結(jié)果顯示141株耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌具三種耐藥模式。其中亞胺培南和美羅培南均耐藥的菌株占最多為94株(66.7％)。141株銅綠假單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率依次為:多粘菌素B＜頭孢吡肟＜哌拉西林-他唑巴坦＜阿米卡星＜頭孢哌酮-舒巴坦＜頭孢他啶＜美羅培南＜哌拉西林＜氨曲南＜左氧氟沙星＜環(huán)丙沙星＜頭孢哌酮＜慶大霉素＜亞胺培南。141株銅綠假單胞菌對(duì)各種抗菌藥物的體外抗菌活性比較結(jié)果顯示,耐亞胺培南的菌株對(duì)哌拉西林-他唑巴坦和阿米

3、卡星仍有46.1％和45.4％的菌株敏感,未發(fā)現(xiàn)多粘菌素B耐藥株。提示在嚴(yán)重銅綠假單胞菌感染患者的治療中,β內(nèi)酰胺類(lèi)加氨基糖苷類(lèi)仍是一個(gè)很好的聯(lián)合用藥組合,多粘菌素B也可以作為一個(gè)備選藥物。
　　 ERIC-PCR分析141株耐碳青霉烯類(lèi)菌株的同源性,研究結(jié)果顯示141株碳青霉烯類(lèi)耐藥銅綠假單胞菌具有A、B、C、E、D、F、G、H、I、J、K共11個(gè)型別,其中以A、B、C3個(gè)型別為主,分別有64,31和29株,提示本院主要存在該

4、3種克隆。A型在各科室均有存在,但主要分布于腦外科,高干病房和中心ICU3個(gè)科室;B型在6個(gè)科室內(nèi)有分布,主要存在于腦外科,高干病房,神經(jīng)內(nèi)科:C型在9個(gè)科室內(nèi)有分布主要分布于腦外科。在腦外科,高干病房,神經(jīng)內(nèi)科、中心ICU和內(nèi)科均存在A、B、C3個(gè)主要克隆。
　　 141株耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌,均為多重耐藥株(MDR),其中19株為泛耐藥株,占13.5％(19/141)。19株P(guān)DR菌株主要分布在腦外科、ICU、腎內(nèi)科和手

5、外科。ERIC-PCR分型結(jié)果分別顯示具有5個(gè)型別,以A和B型為主,分別有6株和7株。該5個(gè)型別分布于多個(gè)科室,未呈現(xiàn)出集中于某一科室的特點(diǎn)。因此,加強(qiáng)對(duì)這些MDR菌株尤其是PDR菌株的監(jiān)測(cè),對(duì)防止耐藥銅綠假單胞菌在各病區(qū)的傳播,降低醫(yī)院感染的發(fā)生率具有十分重要的意義。
　　 第二部分銅綠假單胞菌金屬β內(nèi)酰胺酶研究
　　 近年來(lái)由于亞胺培南等碳青霉烯類(lèi)抗生素在臨床上的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌產(chǎn)生了一類(lèi)能廣泛水解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的

6、金屬β-內(nèi)酰胺酶,產(chǎn)該類(lèi)酶的細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素產(chǎn)生耐藥性,給臨床抗感染治療造成極大困難。本研究用亞胺培南和乙二胺四乙酸(EDTA)紙片法協(xié)同試驗(yàn)和E-試驗(yàn)對(duì)2005年間141株碳青霉烯類(lèi)耐藥銅綠假單胞菌進(jìn)行碳青霉烯酶篩選;并對(duì)產(chǎn)酶株進(jìn)行碳青酶烯酶基因的PCR擴(kuò)增和DNA序列分析;采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分析產(chǎn)酶株同源性;SouthernBlot進(jìn)行耐藥基因的定位;轉(zhuǎn)移接合試驗(yàn)和PCR擴(kuò)增產(chǎn)酶株整合子,以研究耐藥基因的可轉(zhuǎn)移性

7、。
　　 結(jié)果顯示141株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中,僅4株P(guān)A菌株的EDTA協(xié)同試驗(yàn)和E-試驗(yàn)為金屬酶檢測(cè)陽(yáng)性,只占141株耐藥銅綠假單胞菌的2.8％;另有137株耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌中均未檢測(cè)到任何碳青霉烯酶(包括絲氨酸碳青酶烯酶),因此推測(cè)產(chǎn)碳青酶烯酶不是導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制。
　　 設(shè)計(jì)編碼金屬酶(IMP型、VIM型)基因的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA序列分析確認(rèn)為4株

8、銅綠假單胞菌均產(chǎn)生VIM-2金屬酶。4株細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)亞胺培南和美羅培南均耐藥,提示金屬酶能夠同時(shí)水解該兩種抗菌藥物,但均對(duì)氨曲南和多粘茵屬B敏感。接合試驗(yàn)結(jié)果顯示4株產(chǎn)VIM-2金屬酶的銅綠假單胞菌均可通過(guò)接合轉(zhuǎn)移方式傳遞其產(chǎn)VIM-2金屬酶的特性,提示該基因位于質(zhì)粒上,并可以通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移其耐藥性。此外本研究結(jié)果顯示4株產(chǎn)金屬酶菌株均帶有I類(lèi)整合子,提示I類(lèi)整合子可能在細(xì)菌耐藥及多重耐藥中扮演了重要角色。
　　 第三部

9、分耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌外膜蛋白機(jī)制研究
　　 碳青霉烯類(lèi)抗生素是治療銅綠假單胞菌感染的重要抗生素,但隨著該抗菌藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用,銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)的耐藥性在快速上升。碳青霉烯類(lèi)是一類(lèi)分子量較小親水性的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素,可以通過(guò)細(xì)菌外膜上具有通透性功能的孔蛋白OprC、OprD2、OprE擴(kuò)散。本研究對(duì)141株碳青霉烯類(lèi)耐藥(其中140株亞胺培南耐藥)的銅綠假單胞菌的外膜孔蛋白采用PCR方法擴(kuò)增外膜蛋白OprD2

10、編碼基因和SDS-PAGE分析oprD2蛋白的缺失,結(jié)果顯示136株耐藥株OprD2編碼基因發(fā)生顯著變異,變異位點(diǎn)呈現(xiàn)多樣性。其中34株OprD2編碼基因存在大片段缺失,6株顯示OprD2編碼基因中有插入片段,96株有小片段缺失或不同位置的多點(diǎn)突變。另4株產(chǎn)金屬酶菌株及1株亞胺培南敏感(美羅培南耐藥)株OprD2編碼基因未發(fā)現(xiàn)異常。提示這些菌株中OprD2編碼基因的缺失或突變是引起銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制。采用SDS-PAG

11、E分析15株亞胺培南耐藥株OprD2蛋白缺失情況,結(jié)果顯示這些菌株中OprD2蛋白均發(fā)生了缺失或減少。對(duì)該15株OprD2編碼基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)有3株發(fā)生了大片段缺失,其余12株均有小片段缺失或不同位置的多點(diǎn)突變,提示OprD2基因缺失突變是導(dǎo)致OprD2蛋白丟失的分子基礎(chǔ)。
　　 第四部分耐碳青霉烯類(lèi)銅綠假單胞菌多藥外排泵機(jī)制研究
　　 為了解多藥外排泵與耐碳青霉烯類(lèi)抗菌藥之間的關(guān)系,我們對(duì)141株碳青霉烯類(lèi)耐藥(其中9

12、5株美羅培南耐藥)的銅綠假單胞菌的多藥外排泵進(jìn)行了研究。采用瓊脂稀釋法分別測(cè)定了外排泵抑制劑MC207110(20μg/ml)與美羅培南協(xié)同時(shí)141株多重耐藥銅綠假單胞菌的美羅培南MIC值。結(jié)果顯示外排泵抑制劑MC207110可以使94株美羅培南耐藥株的美羅培南MIC值較單藥時(shí)降低4倍或以上,占69.1％;隨機(jī)選取外排泵抑制試驗(yàn)中美羅培南MIC值降低4倍或以上菌株20株,運(yùn)用real-timePCR方法檢測(cè)4種外排泵mRNA的表達(dá),結(jié)果

13、顯示20株美羅培南耐藥銅綠假單胞菌中有4種外排泵基因mRNA表達(dá)水平有增高。其中以MexEF-OprN為最多,共有10株。其次,為MexCD-oprJ,有5株。MexAB-OprM有4株,MexXY-OprM最少,只有3株。其中有2株細(xì)菌MexA和MexC基因mRNA表達(dá)水平同時(shí)增高。提示在這些臨床耐藥菌中,對(duì)美羅培南耐藥有可能是這些外排泵的過(guò)度表達(dá)所致。
　　 PA外排泵的過(guò)度表達(dá)常常由其上游的調(diào)控基因突變所致。20株美羅培南

14、耐藥銅綠假單胞菌的4種外排泵調(diào)控基因測(cè)序結(jié)果顯示MexAB-OprM過(guò)度表達(dá)的菌株中有3株系mexR突變,1株系nalC突變所致,未發(fā)現(xiàn)nalD突變。5株MexCD-OprJ過(guò)度表達(dá)的菌株均發(fā)生了nfxB突變,10株MexEF-OprN高表達(dá)株均有mexT突變,3株MexXY-OprM高表達(dá)株均有mexZ基因突變,提示這些外排泵系統(tǒng)的過(guò)度表達(dá)主要是由于其相應(yīng)的調(diào)節(jié)基因突變所致。
　　 第五部分泛耐藥銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制研究

15、>　　 近年來(lái)銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥率上升顯著,甚至出現(xiàn)了對(duì)所有抗菌藥耐藥的泛耐藥銅綠假單胞菌(PDR-PA)。為了解這些菌株泛耐藥的機(jī)制,本研究通過(guò)對(duì)19株泛耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs的檢測(cè),結(jié)果顯示17株為產(chǎn)VEB-3型ESBL,其中1株同時(shí)產(chǎn)OXA-10型ESBL。19株泛耐藥銅綠假單胞菌的質(zhì)粒AmpC酶檢測(cè)均陰性,碳青霉烯酶檢測(cè)亦均陰性。19株細(xì)菌的OprD2編碼基因測(cè)序分析結(jié)果顯示OprD2編碼基因均發(fā)生小片

16、段缺失。泵抑制劑(MC207110)與美羅培南協(xié)同聯(lián)合檢測(cè)19株泛耐藥菌銅綠假單胞菌外排泵試驗(yàn)結(jié)果顯示有16株美羅培南的MIC較單藥時(shí)的MIC值降低了4倍以上,提示這些菌株具有外排泵機(jī)制。19株泛耐藥銅綠假單胞菌均發(fā)生gyrA突變,其中14株同時(shí)發(fā)生了parC突變,未發(fā)現(xiàn)gyrB和parE突變,Qnr基因的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。采用16種氨基糖苷修飾酶基因引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增,結(jié)果顯示19株泛耐藥銅綠假單胞菌均含有氨基糖苷修飾酶,其中含有an