耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌耐藥機制研究.pdf

1、第一部分銅綠假單胞菌藥物敏感性試驗及同源性分析
　　 銅綠假單胞菌(PA)是醫(yī)院感染的主要病原菌之一,引起臨床多種感染。本課題對復旦大學附屬華山醫(yī)院2005年1月至2005年12月一年間臨床分離的141株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌進行了研究。
　　 瓊脂稀釋法測定141株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌菌株對14種抗菌藥物的敏感性,結果顯示其中有141株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌對亞胺培南和美羅培南耐藥(MIC≥16μg/ml)。藥

2、敏試驗結果顯示141株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌具三種耐藥模式。其中亞胺培南和美羅培南均耐藥的菌株占最多為94株(66.7％)。141株銅綠假單胞菌對各種抗菌藥物的耐藥率依次為:多粘菌素B＜頭孢吡肟＜哌拉西林-他唑巴坦＜阿米卡星＜頭孢哌酮-舒巴坦＜頭孢他啶＜美羅培南＜哌拉西林＜氨曲南＜左氧氟沙星＜環(huán)丙沙星＜頭孢哌酮＜慶大霉素＜亞胺培南。141株銅綠假單胞菌對各種抗菌藥物的體外抗菌活性比較結果顯示,耐亞胺培南的菌株對哌拉西林-他唑巴坦和阿米

3、卡星仍有46.1％和45.4％的菌株敏感,未發(fā)現(xiàn)多粘菌素B耐藥株。提示在嚴重銅綠假單胞菌感染患者的治療中,β內酰胺類加氨基糖苷類仍是一個很好的聯(lián)合用藥組合,多粘菌素B也可以作為一個備選藥物。
　　 ERIC-PCR分析141株耐碳青霉烯類菌株的同源性,研究結果顯示141株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌具有A、B、C、E、D、F、G、H、I、J、K共11個型別,其中以A、B、C3個型別為主,分別有64,31和29株,提示本院主要存在該

4、3種克隆。A型在各科室均有存在,但主要分布于腦外科,高干病房和中心ICU3個科室;B型在6個科室內有分布,主要存在于腦外科,高干病房,神經內科:C型在9個科室內有分布主要分布于腦外科。在腦外科,高干病房,神經內科、中心ICU和內科均存在A、B、C3個主要克隆。
　　 141株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌,均為多重耐藥株(MDR),其中19株為泛耐藥株,占13.5％(19/141)。19株PDR菌株主要分布在腦外科、ICU、腎內科和手

5、外科。ERIC-PCR分型結果分別顯示具有5個型別,以A和B型為主,分別有6株和7株。該5個型別分布于多個科室,未呈現(xiàn)出集中于某一科室的特點。因此,加強對這些MDR菌株尤其是PDR菌株的監(jiān)測,對防止耐藥銅綠假單胞菌在各病區(qū)的傳播,降低醫(yī)院感染的發(fā)生率具有十分重要的意義。
　　 第二部分銅綠假單胞菌金屬β內酰胺酶研究
　　 近年來由于亞胺培南等碳青霉烯類抗生素在臨床上的廣泛應用,細菌產生了一類能廣泛水解β-內酰胺類抗生素的

6、金屬β-內酰胺酶,產該類酶的細菌對β-內酰胺類抗生素產生耐藥性,給臨床抗感染治療造成極大困難。本研究用亞胺培南和乙二胺四乙酸(EDTA)紙片法協(xié)同試驗和E-試驗對2005年間141株碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌進行碳青霉烯酶篩選;并對產酶株進行碳青酶烯酶基因的PCR擴增和DNA序列分析;采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析產酶株同源性;SouthernBlot進行耐藥基因的定位;轉移接合試驗和PCR擴增產酶株整合子,以研究耐藥基因的可轉移性

7、。
　　 結果顯示141株碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌中,僅4株PA菌株的EDTA協(xié)同試驗和E-試驗為金屬酶檢測陽性,只占141株耐藥銅綠假單胞菌的2.8％;另有137株耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌中均未檢測到任何碳青霉烯酶(包括絲氨酸碳青酶烯酶),因此推測產碳青酶烯酶不是導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機制。
　　 設計編碼金屬酶(IMP型、VIM型)基因的引物經PCR擴增獲得的擴增產物經DNA序列分析確認為4株

8、銅綠假單胞菌均產生VIM-2金屬酶。4株細菌藥敏試驗結果顯示對亞胺培南和美羅培南均耐藥,提示金屬酶能夠同時水解該兩種抗菌藥物,但均對氨曲南和多粘茵屬B敏感。接合試驗結果顯示4株產VIM-2金屬酶的銅綠假單胞菌均可通過接合轉移方式傳遞其產VIM-2金屬酶的特性,提示該基因位于質粒上,并可以通過質粒轉移其耐藥性。此外本研究結果顯示4株產金屬酶菌株均帶有I類整合子,提示I類整合子可能在細菌耐藥及多重耐藥中扮演了重要角色。
　　 第三部

9、分耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌外膜蛋白機制研究
　　 碳青霉烯類抗生素是治療銅綠假單胞菌感染的重要抗生素,但隨著該抗菌藥物在臨床上的廣泛應用,銅綠假單胞菌對碳青霉烯類的耐藥性在快速上升。碳青霉烯類是一類分子量較小親水性的β-內酰胺類抗生素,可以通過細菌外膜上具有通透性功能的孔蛋白OprC、OprD2、OprE擴散。本研究對141株碳青霉烯類耐藥(其中140株亞胺培南耐藥)的銅綠假單胞菌的外膜孔蛋白采用PCR方法擴增外膜蛋白OprD2

10、編碼基因和SDS-PAGE分析oprD2蛋白的缺失,結果顯示136株耐藥株OprD2編碼基因發(fā)生顯著變異,變異位點呈現(xiàn)多樣性。其中34株OprD2編碼基因存在大片段缺失,6株顯示OprD2編碼基因中有插入片段,96株有小片段缺失或不同位置的多點突變。另4株產金屬酶菌株及1株亞胺培南敏感(美羅培南耐藥)株OprD2編碼基因未發(fā)現(xiàn)異常。提示這些菌株中OprD2編碼基因的缺失或突變是引起銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要機制。采用SDS-PAG

11、E分析15株亞胺培南耐藥株OprD2蛋白缺失情況,結果顯示這些菌株中OprD2蛋白均發(fā)生了缺失或減少。對該15株OprD2編碼基因測序分析發(fā)現(xiàn)有3株發(fā)生了大片段缺失,其余12株均有小片段缺失或不同位置的多點突變,提示OprD2基因缺失突變是導致OprD2蛋白丟失的分子基礎。
　　 第四部分耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌多藥外排泵機制研究
　　 為了解多藥外排泵與耐碳青霉烯類抗菌藥之間的關系,我們對141株碳青霉烯類耐藥(其中9

12、5株美羅培南耐藥)的銅綠假單胞菌的多藥外排泵進行了研究。采用瓊脂稀釋法分別測定了外排泵抑制劑MC207110(20μg/ml)與美羅培南協(xié)同時141株多重耐藥銅綠假單胞菌的美羅培南MIC值。結果顯示外排泵抑制劑MC207110可以使94株美羅培南耐藥株的美羅培南MIC值較單藥時降低4倍或以上,占69.1％;隨機選取外排泵抑制試驗中美羅培南MIC值降低4倍或以上菌株20株,運用real-timePCR方法檢測4種外排泵mRNA的表達,結果

13、顯示20株美羅培南耐藥銅綠假單胞菌中有4種外排泵基因mRNA表達水平有增高。其中以MexEF-OprN為最多,共有10株。其次,為MexCD-oprJ,有5株。MexAB-OprM有4株,MexXY-OprM最少,只有3株。其中有2株細菌MexA和MexC基因mRNA表達水平同時增高。提示在這些臨床耐藥菌中,對美羅培南耐藥有可能是這些外排泵的過度表達所致。
　　 PA外排泵的過度表達常常由其上游的調控基因突變所致。20株美羅培南

14、耐藥銅綠假單胞菌的4種外排泵調控基因測序結果顯示MexAB-OprM過度表達的菌株中有3株系mexR突變,1株系nalC突變所致,未發(fā)現(xiàn)nalD突變。5株MexCD-OprJ過度表達的菌株均發(fā)生了nfxB突變,10株MexEF-OprN高表達株均有mexT突變,3株MexXY-OprM高表達株均有mexZ基因突變,提示這些外排泵系統(tǒng)的過度表達主要是由于其相應的調節(jié)基因突變所致。
　　 第五部分泛耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制研究

15、>　　 近年來銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率上升顯著,甚至出現(xiàn)了對所有抗菌藥耐藥的泛耐藥銅綠假單胞菌(PDR-PA)。為了解這些菌株泛耐藥的機制,本研究通過對19株泛耐藥銅綠假單胞菌產ESBLs的檢測,結果顯示17株為產VEB-3型ESBL,其中1株同時產OXA-10型ESBL。19株泛耐藥銅綠假單胞菌的質粒AmpC酶檢測均陰性,碳青霉烯酶檢測亦均陰性。19株細菌的OprD2編碼基因測序分析結果顯示OprD2編碼基因均發(fā)生小片

16、段缺失。泵抑制劑(MC207110)與美羅培南協(xié)同聯(lián)合檢測19株泛耐藥菌銅綠假單胞菌外排泵試驗結果顯示有16株美羅培南的MIC較單藥時的MIC值降低了4倍以上,提示這些菌株具有外排泵機制。19株泛耐藥銅綠假單胞菌均發(fā)生gyrA突變,其中14株同時發(fā)生了parC突變,未發(fā)現(xiàn)gyrB和parE突變,Qnr基因的檢測結果均為陰性。采用16種氨基糖苷修飾酶基因引物,經PCR擴增,結果顯示19株泛耐藥銅綠假單胞菌均含有氨基糖苷修飾酶,其中含有an