系膜細(xì)胞中TIMP-1調(diào)控單核細(xì)胞趨化因子CCL2和分化因子PAQRB的機(jī)制研究.pdf

1、背景:系膜增殖性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MesPGN)是根據(jù)病理學(xué)形態(tài)來(lái)定義的疾病，包括IgA腎病和非IgA腎病。系膜增殖性腎炎經(jīng)典的動(dòng)物模型是抗Thy-1腎炎模型，分為系膜溶解期，系膜增殖期，系膜增殖恢復(fù)期。細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(Tissue inhibitors of Metalloproteinases，TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix M

2、etalloproteinases，MMPs)的內(nèi)源性抑制劑，它作為細(xì)胞因子發(fā)揮非MMPs依賴的對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)控。前期工作中，大鼠抗Thy-1腎炎模型基因芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，TIMP-1和細(xì)胞因子C-C chemokine ligand2(CCL2)的表達(dá)水平在系膜溶解期開(kāi)始上調(diào)，系膜增殖期達(dá)到高峰，在增殖恢復(fù)期又逐漸降低。CCL2是將單核巨噬細(xì)胞募集至炎癥部位的細(xì)胞因子，NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進(jìn)CCL2在多種細(xì)胞的表達(dá)。

3、因此我們推斷TIMP-1可能通過(guò)NF-κB介導(dǎo)CCL2上調(diào)，從而調(diào)控系膜溶解期和系膜增殖期的免疫炎癥反應(yīng)。單核巨噬細(xì)胞分化因子(Monocyte to macrophage differentiation-associated，MMD)主要由MMD基因(PAQRB基因)編碼，主要功能為誘導(dǎo)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化。我們推斷在系膜增殖性腎小球腎炎中，TIMP-1通過(guò)NF-κB上調(diào)CCL2的表達(dá)，促進(jìn)單核細(xì)胞在炎癥部位的募集，并通過(guò)促進(jìn)PA

4、QRB的表達(dá)，將單核細(xì)胞分化為單核巨噬細(xì)胞，參與免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。
　　目的:利用Taqman探針技術(shù)驗(yàn)證TIMP-1和CCL2在大鼠抗Thy-1腎炎中的表達(dá)水平變化;利用Taqman探針?lè)ê偷鞍踪|(zhì)印跡法(WestemBlot)檢測(cè)TIMP-1對(duì)細(xì)胞因子CCL2的調(diào)控作用;阻斷高表達(dá)系膜細(xì)胞模型中NF-κB的水平并驗(yàn)證下游CCL2的表達(dá)變化;利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)得到TIMP-1高表達(dá)時(shí)的下游差異基因表達(dá)譜;利

5、用Taqman探針?lè)?yàn)證下游差異基因PAQRB的mRNA表達(dá)水平。
　　方法:(1)制備大鼠抗Thy-1腎炎模型，分別在第0天（對(duì)照組）、第1天、第3天、第4天、第5天、第7天（均為模型組）處死大鼠，研磨得到腎小球。利用Taqman探針?lè)z測(cè)TIMP-1和CCL2在抗Thy-1腎炎各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。(2)利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)建立TIMP-1高表達(dá)與低表達(dá)的大鼠系膜細(xì)胞(RMC)模型。利用GFP-TIMP-1慢病毒轉(zhuǎn)染RMC的方法建

6、立高表達(dá)模型，并于第3天起觀察細(xì)胞熒光表達(dá);設(shè)計(jì)TIMP-1小干擾RNA序列并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建低表達(dá)模型。(3)收集TIMP-1高表達(dá)RMC模型第6天的細(xì)胞和TIMP-1低表達(dá)模型中第48小時(shí)的細(xì)胞，利用Taqman法和蛋白印跡法(Werstem blot)檢測(cè)TIMP-1，MMP2，MMP9，NF-κB和CCL2的mRNA和蛋白表達(dá)水平。(4)在TIMP-1高表達(dá)系膜細(xì)胞模型第4天加入NF-kB阻斷劑BAY11-7082(5μm

7、ol/L)，培育48小時(shí)后，提取細(xì)胞RNA。利用Taqman探針?lè)z測(cè)CCL2的mRNA表達(dá)水平變化。(5)對(duì)TIMP-1高表達(dá)系膜細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到差異基因表達(dá)譜，利用生物信息學(xué)分析關(guān)鍵基因PAQRB的作用。(6)利用RT-PCR法驗(yàn)證PAQRB在TIMP-1高表達(dá)與低表達(dá)模型中的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)在大鼠抗Thy-1腎炎模型中，TIMP-1和CCL2的表達(dá)水平呈現(xiàn)先升高再恢復(fù)正常的趨勢(shì)，其中TIMP-1在第3天，第5

8、天和第7天升高明顯，第5天達(dá)到峰值。CCL2在第2天達(dá)到峰值。(2)成功建立TIMP-1高表達(dá)與低表達(dá)的大鼠系膜細(xì)胞模型。轉(zhuǎn)染后表達(dá)熒光的效率達(dá)90％。(3) TIMP-1表達(dá)升高時(shí)，MMP9，NF-κB和CCL2的表達(dá)顯著升高(P＜0.05);反之當(dāng)TIMP-1表達(dá)降低時(shí)，MMP9，NF-κB和CCL2表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。MMP2的變化則不明顯。(4)當(dāng)阻斷NF-κB48小時(shí)后，TIMP-1高表達(dá)系膜細(xì)胞模型中CCL2明顯降

9、低(P＜0.05)。(5)TIMP-1調(diào)控許多與細(xì)胞增殖/凋亡、細(xì)胞分化、免疫炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的蛋白，參與系膜增殖性腎小球腎炎的免疫炎癥反應(yīng)。TIMP-1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分化因子(PAQRB)的分泌，后者促進(jìn)單核細(xì)胞的分化。(6) TIMP-1表達(dá)升高時(shí)，PAQRB的表達(dá)顯著升高(P＜0.05);反之當(dāng)TIMP-1表達(dá)降低時(shí)，PAQRB表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:在大鼠系膜細(xì)胞中，TIMP-1可以通過(guò)激活N