巴馬香豬ENU誘變建立兩個遺傳性出生缺陷模型家系的研究.pdf

1、出生缺陷(birth defects，BD)是指由于遺傳或環(huán)境的因素影響了胚胎或胎兒的正常發(fā)育，出生后表現(xiàn)出的身體結構的缺陷或功能障礙，往往造成患兒的致病、致殘、致畸或致死。
　　乙烷亞硝甚脲(ethylnitrosourea，ENU)是一種強有力的化學誘變劑，主要誘發(fā)單堿基發(fā)生突變，通過對動物進行ENU誘變篩選可以獲得很多由基因突變導致的疾病表型，從而為人類醫(yī)學研究提供相應的遺傳性疾病動物模型。研究表明，ENU對小鼠的突變效率高

2、達0.2％，而且這種突變是隨機的，不具有任何的傾向性，與以基因敲除為代表的典型的基因驅(qū)動法相比，規(guī)模更大、速度更快、挖掘基因的力度更高。采用這種高效的隨機誘變方法對生長周期短的多胎動物進行誘變，有望在短時間內(nèi)獲得數(shù)量可觀的突變個體，我們可以通過表型篩選以獲得我們感興趣的突變類型。ENU人工誘變已經(jīng)在果蠅、斑馬魚、小鼠等動物中被證明是一種發(fā)現(xiàn)新的功能基因的有效方法，但在大動物上進行人工誘變以創(chuàng)造新的基因資源在國際上仍屬空白。豬的基因組相比

3、小鼠基因組更接近于人類，通過人工誘變我們可以尋找到一些在小鼠中難以發(fā)現(xiàn)的人類遺傳性疾病相關的基因。
　　目的:
　　建立巴馬香豬ENU誘變篩選突變表型的技術體系;通過表型鑒定重點篩查出生缺陷表型并建立穩(wěn)定遺傳的家系，為研究相應的人類出生缺陷疾病的作用機制提供穩(wěn)定可靠的動物模型及相關材料。
　　方法:
　　1.巴馬香豬ENU誘變
　　挑選4-12月齡成年健康巴馬公豬81頭，按不同的ENU劑量分為7組:45mg

4、/kg組，4頭;65mg/kg組，9頭;75mg/kg，11頭;85mg/kg，35頭;90mg/kg，11頭;95mg/kg，7頭;105 mg/kg，4頭。ENU采用耳靜脈滴注，每頭公豬按相應劑量共注射3次，每周一次，連續(xù)三周。注射誘變劑后每隔1周人工采集公豬精液監(jiān)測其精液品質(zhì)，待精液活力恢復至30％以上，誘變公豬作為F0代與野生型母豬配種，產(chǎn)生F1代個體。從誘變F0公豬中挑選了兩個誘變家系（包括F0父母和5頭F1后代，家系ⅠENU

5、注射量為65mg/kg，家系Ⅱ ENU注射量為85mg/kg），采用簡化基因組測序法(Restriction site Associated DNA Sequencing，RAD-Seq)對其ENU引入的突變及其頻率進行分析和評估。對出生的F1代進行表型鑒定，重點篩查出生缺陷突變表型。對存活至成年的突變F1代公豬（或母豬），以野生型母豬（或公豬）與之交配，對其出生的F2代進行表型鑒定，若出現(xiàn)與F1代突變表型相同的性狀，進一步按顯性家系建

6、系擴繁;若突變表型在F2代未能遺傳，則按隱性家系建立方案進行建系工作。同時選留一定數(shù)量無突變表型的F1公豬直接建立隱性家系:F1公豬與野生型母豬交配后在其F2代中選留4頭以上母豬再與F1公豬回交，對出生的F3代進行表型鑒定重點篩選出生缺陷突變表型。
　　2.巴馬香豬ENU誘變獲得腹股溝疝伴發(fā)先心病模型家系的建立與研究
　　對獲得的突變家系進行詳細準確的表型鑒定:對腹股溝疝表型進行多次外觀鑒定，并結合手術解剖加以確認;詳細記錄

7、患病豬只腹股溝疝發(fā)生的部位、大小、類型及其并發(fā)癥。結合家系系譜圖，按患病個體發(fā)生的比例分析該家系腹股溝疝可能的遺傳模式。以Illumiina60K豬SNP芯片對該家系豬只進行全基因組掃描分析，確定腹股溝疝可能的易感位點，通過生物信息學方法查找分析易感位點附近的基因，設定易感候選基因后進行外顯子測序。對家系內(nèi)所有F3代豬進行血液生理生化指標檢測，心電圖、B超等臨床特征檢查以獲得與腹股溝疝發(fā)病相關的詳細的臨床基礎數(shù)據(jù)。對患豬手術過程中切取的

8、疝環(huán)組織及疝囊組織作病理切片及免疫組化分析。結合心電圖、B超及心臟解剖判定結果，統(tǒng)計分析該家系腹股溝疝與先心病發(fā)病的關聯(lián)性。
　　3.巴馬香豬ENU誘變獲得白化合并生長遲緩及后肢癱瘓復合疾病家系的建立與研究
　　分別對白化、生長遲緩及后肢癱瘓疾病表型進行遺傳學分析，通過候選基因外顯子直接測序的方法對家系成員分別進行白化、生長遲緩及后肢癱瘓相關致病基因進行突變檢測分析。
　　結果:
　　1.巴馬香豬ENU誘變

9、>　　1.1 誘變公豬恢復及配種繁殖情況:ENU誘變處理后，公豬無精期時間隨劑量升高而增加，但不完全一致，存在個體差異;精液質(zhì)量恢復率（精子活率恢復至70％以上，密度＞107個/mL）隨劑量升高而增加，但不完全一致，存在個體差異，高劑量個體部分無法恢復生育能力;誘變恢復后的公豬各劑量組間繁殖性能（返情率、妊娠率、平均窩產(chǎn)仔數(shù)）無明顯差異，原因可能受季節(jié)、受配母豬、統(tǒng)計誤差等多種因素的影響。
　　1.2 F1代ENU引入突變分析:F

10、1代ENU引入突變的平均頻率在65mg/kg和85mg/kg劑量分別為1.63×10-6和5.86×10-6;突變類型主要為G-A類型的突變，且總體上轉換類型的突變占71.2％;突變分布符合基因組組成比例，即大量的ENU引入的突變分布在intergenic區(qū)域（基因間區(qū)）和內(nèi)含子區(qū)域，編碼區(qū)由于在基因組中所占比例較少，因此誘變產(chǎn)生的突變相應地較少。
　　1.3 誘變家系組建及突變體篩選:F1代篩選到突變體126個，出生缺陷包括腳趾

11、畸形、短尾、腹壁缺損、彎尾、四肢發(fā)育異常、顱骨發(fā)育不全、腦膨出、歪鼻等，其中大部分為致死性。我們對其中51頭存活至成年的突變個體進行了建系驗證其遺傳性，除2頭白化個體遺傳外，其余均無遺傳。
　　在已完成建系的11個隱性家系中發(fā)現(xiàn)7個家系具有突變表型，其中6個家系均表現(xiàn)為腹股溝疝，另1個家系為毛色白化合并生長遲緩表型。
　　2.巴馬香豬ENU誘變獲得腹股溝疝模型家系的建立與研究
　　2.1 腹股溝疝遺傳模式分析:獲得的腹

12、股溝疝大家系其腹股溝疝為限性性狀，F(xiàn)3代發(fā)病率為65％，遠遠高于單基因隱性遺傳理論百分比的25％，其遺傳模式較為復雜，目前無法明確，有待進一步研究。
　　2.2 Illumiina60 K豬SNP芯片全基因組掃描發(fā)現(xiàn)在第10號染色體第10138848bp處有一個強的信號位點(P=0.00022)。
　　2.3 以SPATA17為候選基因進行的外顯子測序，未找到與腹股溝疝表型相符合的突變。
　　2.4 病理切片顯示腹股溝

13、疝患豬腹環(huán)周圍肌肉組織出現(xiàn)肌肉萎縮，肌纖維組織間質(zhì)炎性細胞浸潤，血管淤血，神經(jīng)纖維變性，肌肉組織間脂肪組織營養(yǎng)不良等病理變化;透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)患病豬只疝囊組織中膠原纖維出現(xiàn)變性、萎縮、斷裂及降解等病變;免疫組化分析發(fā)現(xiàn)患病豬只疝囊組織中Ⅰ型膠原含量及Ⅰ型膠原與Ⅲ型膠原含量的比例均低于正常豬對應部位腹橫筋膜中的含量(P＜0.05)，而Ⅲ型膠原含量則高于正常豬(P＜0.05)，Ⅰ型和Ⅲ型膠原含量總和在兩組中無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

14、r>　　2.5 先心病發(fā)病率在F3代疝氣豬中高達20.6％，在總的公豬中為13.5％，非疝氣公豬中未檢測出先心病;盡管母豬不患疝氣，但先心病患病率為16.3％，與家系F3代群體總發(fā)病率(14.9％)及F3代總體公豬中先心病患病率接近。
　　3.巴馬香豬ENU誘變獲得白化合并生長遲緩及后肢癱瘓復合疾病表型家系的建立與研究
　　3.1 針對F3代白化表型進行的MC1R候選基因外顯子測序發(fā)現(xiàn)突變個體在該基因第894位堿基處插入了C

15、C兩個堿基。
　　3.2 針對生長遲緩性狀進行的MC3R及MC4R候選基因外顯子測序未發(fā)現(xiàn)與表型相符合的突變。
　　3.3 針對F4代后肢癱瘓表型進行的SMN1候選基因外顯子測序未發(fā)現(xiàn)該基因有突變。
　　結論:
　　1.本課題首次在大型實驗動物巴馬香豬上成功建立了ENU誘變體系，探索并確定了小型豬ENU誘變合適的劑量和方法，證實了ENU誘變體系在小型豬上應用的可行性。
　　2.本研究獲得了大量出生缺陷突變表

16、型，但大部分未能遺傳，原因可能是大多數(shù)出生缺陷為致死性或為多基因遺傳控制。
　　3.通過巴馬香豬ENU誘變建立了能穩(wěn)定遺傳的腹股溝疝伴發(fā)先心病的大動物模型家系，研究表明腹股溝疝與先心病存在很大的相關性，其發(fā)病機制可能與膠原代謝異常有關;盡管其遺傳模式仍不明確，確切的分子遺傳機制也需進一步研究，但該家系的獲得和建立可為人腹股溝疝病理機制及先心病的研究提供穩(wěn)定可靠的動物模型和研究材料。
　　4.獲得并建立了白化合并生長遲緩及后肢

17、癱瘓復合疾病家系。其中白化性狀為MC1R基因第894堿基處插入CC兩個堿基引發(fā)的突變導致。該插入突變并不符合ENU誘變以單堿基顛換或轉換為主的單堿基點突變類型，提示研究納入的巴馬香豬群體本身就可能攜帶MC1R基因的隱性突變。同時，通過查閱文獻表明，我們在這一隱性白化巴馬香豬發(fā)現(xiàn)的MC1R基因的插入突變?yōu)樨iMC1R基因的一個新突變。生長遲緩性狀及后肢癱瘓性狀尚未鑒定到致病基因，加上F1代突變公豬的腳趾畸形性狀并未能遺傳，提示ENU誘變可能