兩個(gè)攜帶線粒體ND1 T3394C突變的Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系的相關(guān)研究.pdf

1、目的：
　　 1.在全國各地收集視神經(jīng)萎縮家系，然后建立臨床、家系資料以及分子遺傳學(xué)資料數(shù)據(jù)庫。
　　 2.在收集的視神經(jīng)萎縮家系及正常對(duì)照中篩查與Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)相關(guān)的線粒體DNA(mtDNA)三個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)（ND1/G3460A、ND4/G11778A、ND6/T14484C），繪制中國LHON人群的突變頻譜。
　　 3.對(duì)其中兩個(gè)具有典型臨床表現(xiàn)和家族史并同時(shí)攜帶有原發(fā)突變位點(diǎn)及T3

2、394C突變的LHON家系先證者進(jìn)行線粒體DNA(mtDNA)全基因組進(jìn)行研究分析。
　　 4.進(jìn)一步分析ND1基因T3394C突變對(duì)LHON發(fā)病的分子機(jī)制，為LHON的診療提供新的依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.通過與北京中醫(yī)藥大學(xué)東方眼科醫(yī)院、中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院、河北省邢臺(tái)市眼科醫(yī)院和溫州醫(yī)學(xué)院附屬眼視光醫(yī)院合作，以及全國其它醫(yī)院送來的家系，構(gòu)建視神經(jīng)萎縮家系的各地收集網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)所有受試者同意和溫州醫(yī)

3、學(xué)院倫理道德委員會(huì)的許可，簽署知情同意書后，最后采集外周靜脈（肘靜脈）血樣3～5mL，并收集詳細(xì)的臨床和家系資料（其中包括用Cyrillic軟件繪家系圖）。
　　 2.對(duì)受試對(duì)象（包括患者和正常對(duì)照）進(jìn)行詳細(xì)具體的眼科臨床檢查，包括檢測(cè)視力（應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)國際對(duì)數(shù)視力表），色覺檢查（應(yīng)用俞自萍色覺圖），視野檢查（應(yīng)用Humphrey視野計(jì)），VEP(應(yīng)用德國羅蘭電生理儀)以及眼底彩照（應(yīng)用佳能眼底數(shù)碼彩照）。
　　 3.用經(jīng)典

4、的酚-氯仿抽提法或DNA提取試劑盒法提取全基因組DNA（包含mtDNA）并以其作為PCR擴(kuò)增模板，對(duì)先證者及家系母系成員原發(fā)突變G11778A、G3460A和T14484C所在的3個(gè)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后，最后應(yīng)用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。
　　 4.對(duì)兩個(gè)同時(shí)攜帶有T3394C突變和原發(fā)突變位點(diǎn)的LHON家系先證者進(jìn)行進(jìn)一步的眼科臨床檢查，詳細(xì)詢問家族史并記錄。然后使用設(shè)計(jì)好的24對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行線粒體全基因擴(kuò)增、

5、純化和測(cè)序。
　　 5.使用生物軟件（包括DNAStar5.0、Chromas2.24、Clustal X1.83等）對(duì)測(cè)序結(jié)果與劍橋序列（NC_012920）進(jìn)行比對(duì)分析，確定線粒體基因變異位點(diǎn)及其單體型，分析ND1 T3394C對(duì)LHON發(fā)病的影響。
　　 6.根據(jù)Genbank選取17種不同進(jìn)化物種如:人(Homo sapiens)、牛(Bostaurus)、鼠（Musmusculus）、非洲爪蟾(Xenopus

6、laevis)等不同物種對(duì)線粒體序列進(jìn)行種系發(fā)生學(xué)分析。
　　 7.同樣，收集116例正常對(duì)照（僅限漢族人群）根據(jù)上述所述方法抽取3～5mL外周靜脈血后進(jìn)行線粒體基因分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.自2004年以來，到2012年12月，本課題組已收集了1218個(gè)視神經(jīng)萎縮家系，其中攜帶LHON三個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)的家系504個(gè)，包括429個(gè)G11778A突變家系、16個(gè)G3460A突變家系、59個(gè)T14484C突變家

7、系。
　　 2.這兩個(gè)家系表現(xiàn)有典型的LHON臨床癥狀和遺傳學(xué)特點(diǎn)，家系母系成員分別為17位和13位，外顯率分別為24％和46％。
　　 3.對(duì)家系進(jìn)行mtDNA全序列測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)其攜帶原發(fā)突變外，還有其它堿基突變，mtDNA單體型均屬于東亞單體型M9a。在這所有的突變中有很有意義的ND1亞基上高度保守的T3394C突變。
　　 4.在116例正常對(duì)照中發(fā)現(xiàn)4例攜帶有T3394C突變。
　　 結(jié)論：

8、>　　 1.三個(gè)原發(fā)突變位點(diǎn)存在中國LHON患者中，但并不是每個(gè)攜帶者均出現(xiàn)LHON癥狀。中國LHON人群中，T14484C突變頻率和白種人接近，G3460A突變的頻率明顯低于白種人，但是G11778A突變頻率則明顯高于白種人。
　　 2.這兩個(gè)家系具有典型的LHON臨床表現(xiàn)和家族遺傳特點(diǎn)，而且外顯率較高，G11778A和T14484C分別是其主要的致病因素。
　　 3.3394位于ND1第30位保守性位置，其突變使得