NRSE-RE-1序列與小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)細胞誘導分化的關(guān)系.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴重地威脅著人類的身體健康，其中帕金森病、阿爾茨海默病、脊髓損傷等均是由于受損的分化成熟的神經(jīng)細胞，不能通過神經(jīng)細胞分裂增殖得到修復所引起。胚胎干細胞(Embryonic stem cells，ESCs)來自囊胚內(nèi)細胞團，在體外可長期自我復制并且具有分化出三個胚層細胞的多潛能性。很多研究表明其可在體外誘導分化為神經(jīng)細胞，并可將其移植來修復神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。但是，目前人們?nèi)圆粔蛄私馀咛ジ杉毎蛏窠?jīng)細胞分化的確切機制。 有

2、文獻報道，REST/NRSF表達產(chǎn)物能與神經(jīng)元分化基因啟動子區(qū)域的NRSE/RE-1序列結(jié)合，抑制神經(jīng)元分化基因的表達。在體內(nèi)自然分化的神經(jīng)細胞中，REST/NRSF表達明顯下調(diào)，因此認為其為神經(jīng)元分化的負向調(diào)節(jié)基因。 本課題組已建立了將小鼠胚胎干細胞誘導分化為神經(jīng)元的“序貫誘導”法，并對胚胎干細胞向神經(jīng)元分化機制做初步研究，研究結(jié)果表明： 1、基因表達芯片研究證實，REST/NRSF在ESCs向神經(jīng)細胞分化過程中明顯降

3、低，而其蛋白作用的含有NRSE/RE-1序列眾多神經(jīng)元分化基因的表達量卻普遍升高。 2、通過RNAi技術(shù)直接在轉(zhuǎn)錄水平上干擾REST/NRSF與神經(jīng)元分化基因的結(jié)合，促進神經(jīng)元基因的表達，實現(xiàn)了mESCs向神經(jīng)細胞的誘導分化。 本研究選擇了部分含有NRSE/RE-1序列的基因，即P2ry12，Nptxr,Syp，BDNF，Syt2，Syt7，Ntrk3,Cdh4,Cacna2d3，Atp2b2,Rgs7。應用real-t

4、ime PCR等方法進行精確定量分析其在體外應用“序貫誘導法”分化過程中的表達變化，研究其在胚胎干細胞向神經(jīng)元誘導分化的作用機理，并探討胚胎干細胞向神經(jīng)元誘導分化的主導基因，及可能的分化標志基因。 方法： 1、ESCs培養(yǎng)及誘導分化 ESCs(鼠ES細胞系A(chǔ)B2.1由美國南加州大學醫(yī)學院惠贈)按常規(guī)培養(yǎng)于飼養(yǎng)層細胞上。誘導分化時去飼養(yǎng)層細胞，重新接種于無包被的培養(yǎng)皿中，使用NSC培養(yǎng)液，逐漸更換為無血清NSC培養(yǎng)

5、液。 2、鑒定未分化及誘導分化后細胞 (1)堿性磷酸酶染色鑒定未分化ESCs。 (2)免疫熒光法檢測神經(jīng)干細胞及成熟神經(jīng)元特異性抗原nestin、NCAM1、NSE、NeuN和GFAP。 (3)NCAM1、DAPI復染測定分化比率 3、篩選分化過程中主導基因 采用real-time PCR法對篩選出的11個基因在未分化及分化后第4、10天，定量分析其變化規(guī)律。 結(jié)論： 1、