干細胞向神經細胞分化的影響.pdf

1、背景與目的：
　　microRNAs是一類高度保守的、非編碼內源性小RNA分子，對機體正常的生長發(fā)育及疾病的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用。Let-7家族成員對骨髓間充質干細胞（MSCs）的分化起著重要的作用，了解微小RNA let-7d對MSCs向神經細胞分化的影響可以促進顱內干細胞移植的發(fā)展。本文通過體外構建let-7d慢病毒載體并轉染MSCs來探討let-7d在MSCs向神經細胞分化過程中的作用。
　　方法：
　　1.構

2、建大鼠慢病毒載體，分別為轉染空白慢病毒、轉染let-7d目的基因，轉染抑制let-7d表達的目的基因，并用這些慢病毒載體轉染大鼠MSCs；根據轉染的慢病毒載體的不同，實驗分為4個組：即轉染上調組(轉染let-7d-LV)、轉染下調組(轉染let-7d-inhibition-LV)、陰性對照組(轉染空白慢病毒)、未轉染組。
　　2.MTT法檢測轉染后細胞的存活率。
　　3.采用法舒地爾誘導轉染后的各組MSCs促使其分化為神經細

3、胞，
　　4.以免疫細胞化學法檢測分化后細胞表面NSE、MAP-2的表達變化，以確定MSCs已分化為神經細胞；
　　5.應用RT-PCR、Western bolt法檢測分化后神經細胞MAP-2 mRNA的表達量，以確定MSCs分化為神經細胞的效率；
　　結果：
　　1.在倒置熒光顯微鏡下觀察到轉染的MSCs有熒光顯示，提示let-7d慢病毒載體轉染成功。各組之間細胞的熒光強度無明顯差異，提示不同組別之間細胞的轉染

4、效率無明顯差異。
　　2.MTT法檢測細胞存活率，發(fā)現轉染上調組、轉染下調組及陰性轉染組的細胞存活率之間無顯著差異(P＞0.05)，但此三組細胞存活率均低于未轉染組。
　　3.在轉染后的各組細胞之間加入法舒地爾，發(fā)現細胞形態(tài)發(fā)生變化，免疫細胞化學法發(fā)現高表達神經元標志物NSE、MAP-2，表明法舒地爾可以誘導MSCs向神經細胞分化。
　　4.免疫細胞化學法發(fā)現轉染上調組細胞的NSE、MAP-2的熒光強度高于陰性對照組和

5、轉染下調組(P＜0.05)，而轉染下調組細胞的NSE、MAP-2的熒光強度低于陰性對照組和轉染下調組(P＜0.05)。
　　5.RT-PCR法檢測MAP-2 mRNA表達量，發(fā)現轉染上調組細胞的MAP-2表達量高于陰性對照組和轉染下調組(P＜0.05)，而轉染下調組細胞的MAP-2表達量低于陰性對照組和轉染下調組(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.let-7d慢病毒載體可以在體外轉染大鼠MSCs，并且可以用于實驗研