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文檔簡介
1、背景:流行病學(xué)分析顯示當今社會導(dǎo)致死亡的主要疾病主要為高血壓,冠心病等心血管疾病,但隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)與研究手段的發(fā)展,這方面的救治成功率得到了明顯提高。雖然心血管病的致死率逐年降低,但它們最終的轉(zhuǎn)歸即慢性心力衰竭卻呈現(xiàn)日益增加,因此救治慢性心力衰竭成為防治的重點。慢性心衰出現(xiàn)后心肌功能多受損,原因各有不同。慢心衰前期多會出現(xiàn)心肌肥厚,心肌肥厚又是導(dǎo)致慢性心衰的重要原因之一,二者互為因果。
近年來在多種生命體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新的小分子R
2、NA,microRNAs,具有調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的活性,更進一步又發(fā)現(xiàn)很多microRNAs與心肌肥厚密切相關(guān)。microRNAs若要發(fā)揮生物學(xué)的功能,它的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物必須經(jīng)過多次酶剪切加工后形成成熟的microRNAs。過程如下最初的microRNAs經(jīng)過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄后,首先形成初始microRNAs(Pri-microRNAs),再經(jīng)Drosha剪切,變成前體rnicroRNAs(Pre-microRNAs),有其特有的發(fā)卡結(jié)構(gòu);Pr
3、e-microRNAs從胞核轉(zhuǎn)運至胞漿,此過程由Exportin-5參與,在胞漿中被Dicer酶剪切,形成雙鏈microRNAs分子;最后,雙鏈microRNAs分離,只有一條成為成熟的microRNAs,再與別的分子一起形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC),RISC再通過與mRNA的3'端非編碼區(qū)相互作用,引起靶基因mRNA的降解或者翻譯抑制,就是前面所講在轉(zhuǎn)錄后負性調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達。rnicroRNAs通過轉(zhuǎn)錄后負性調(diào)節(jié)目的蛋白質(zhì)
4、參與許多心血管疾病。
我們通過升主動脈縮窄(transverse aorta constriction,TAC)對小鼠進行短期與長期的壓力負荷,建立了心肌肥厚與心力衰竭的模型,同時對實驗小鼠進行miR-455的上調(diào),旨在探討miR-455在壓力負荷心肌肥厚中的細胞與分子學(xué)機制,為預(yù)防與治療心肌肥厚提供新的思路。
第一部分 miR-455通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白促進短期壓力負荷心肌肥厚的心肌細胞肥大
目的:最近研究顯
5、示,microRNAs與多種心血管疾病有關(guān),但是迄今為止并沒有miRNA-455(miR-455)與心肌肥厚的研究。我們通過小鼠升主動脈縮窄(transverse aorta constriction,TAC)2周建立了心肌肥厚的模型,旨在探討miR-455在心肌肥厚中細胞與分子學(xué)機制。
方法:選用18只昆明種小鼠,隨機分為手術(shù)結(jié)扎(升主動脈縮窄)+miR-455為實驗組(TAC.miR-455,尾靜脈注射包被miR-455的
6、腺病毒),手術(shù)結(jié)扎+GFP為陰性對照組(TAC.GFP,尾靜脈注射包被綠色熒光蛋白的腺病毒)和假手術(shù)組(Sham,尾靜脈注射包被綠色熒光蛋白的腺病毒)。術(shù)后2周測量小鼠血流動力學(xué)及心臟超聲數(shù)據(jù);對心肌組織進行HE和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化;應(yīng)用qRT-PCR方法檢測肥大基因與纖維化基因的表達;Westem blot分析凋亡蛋白;qRT-PCR與Western blot分析miR-455的靶基因和蛋白。
結(jié)果:
7、 1、miR-455在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染
在尾靜脈注射GFP的TAC后2周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的降低,而經(jīng)過尾靜脈注射miR-455前體的TAC后2周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的升高,TAC.GFP組與Sham組相比較,TAC.miR-455組與TAC.GFP組相比較均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。
2、miR-455對TAC后2周小鼠血流動力學(xué)及心臟超聲和組織病理學(xué)的影響
2周時,經(jīng)右側(cè)頸
8、動脈測壓顯示,同Sham組比較,TAC小鼠BP和LVESP明顯升高,其差值有統(tǒng)計學(xué)意義,但是同Sham組比較,TAC2周時LVEDP無明顯變化。2周時,TAC.GFP組與Sham組比較,心肌細胞橫截面積增大,心重體重比增加,LVAWd明顯增加,LVIDd變小,EF增加,其差值有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這些指標在TAC.miR-455組有了進一步的發(fā)展(P<0.05),如心肌細胞橫截面積進一步增大,心重體重比,LVAWd,EF增加,L
9、VIDd變小,但EF值2組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
3、miR-455對心肌肥厚基因的影響
我們評估了基因轉(zhuǎn)染后心肌肥厚基因Anf, Acta1和Myh7的表達。2周時和Sham組相比較,TAC.GFP組小鼠心肌組織中Anf, Acta1和Myh7有明顯增加(P<0.01),而且在TAC.miR-455組,Anf, Acta1和Myh7的表達有進一步增加(P<0.01)。
4、miR-455對心肌纖維
10、化的影響
2周時通過Masson染色,Sham組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細胞間隙中,呈現(xiàn)藍色,心肌細胞呈紅色,我們觀察到TAC.GFP組和TAC.miR-455組較之于Sham組心肌膠原纖維明顯增加,但2者相比差異不明顯。對于代表心肌纖維化的基因Tgfβ1和Ctgf,較之于Sham組,在TAC.GFP組和TAC.miR-455組的表達都有明顯上升(P<0.05),但2者比較無明顯差異(P>0.05)。
5、mi
11、R-455對心肌細胞凋亡的影響
Western blot示2周時TAC.GFP組促凋亡蛋白Bax有明顯上升,TAC.miR-455組變化不明顯(P<0.05)。TAC.GFP組和TAC.miR-455組抗凋亡蛋白Bcl-2有所下降,但兩者比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
6、在TAC導(dǎo)致的心肌肥厚中鈣網(wǎng)蛋白是miR-455的target gene
我們進行了Calr和GRP78基因與蛋白的檢測,Weste
12、rn blot分析,TAC.GFP組Calr和GRP78升高,但經(jīng)過了miR-455的干擾,GRP78依然升高,而Calr卻有了明顯下降,說明Calr是miR-455的target gene之一。PCR示Calr下降同時也有Calr mRNA的下降,說明miR-455對Calr的調(diào)節(jié)是通過降低mRNA來抑制蛋白翻譯。
小結(jié):短期壓力負荷后小鼠出現(xiàn)了代償性心肌肥厚的特征,表現(xiàn)為心室壁的增厚,心室腔的縮小以及心臟收縮功能的增強,出
13、現(xiàn)明顯心肌細胞增大,病理學(xué)出現(xiàn)明顯心肌細胞增大。伴隨出現(xiàn)胎兒基因的重新激活。miR-455通過降解靶mRNA,Calr降低這條途徑,使得心肌細胞進一步增大,心肌肥厚更加明顯。
第二部分 miR-455通過調(diào)控鈣網(wǎng)蛋白減輕長期壓力負荷心肌肥厚小鼠的心肌纖維化和心肌凋亡
目的:心肌肥厚出現(xiàn)后,左心室重構(gòu)進行性進展,會導(dǎo)致猝死、心力衰竭、心律失常等嚴重心臟事件。左室重構(gòu)主要表現(xiàn)為:心肌細胞肥大、心肌凋亡增加、非心肌細胞(成
14、肌纖維細胞),非細胞成分(膠原纖維)增加和心肌電生理以及代謝異常。我們構(gòu)建了TAC后4周心力衰竭的小鼠,同時用miR-455進行干擾,以期了解miR-455對心肌纖維化和細胞凋亡的分子生物學(xué)影響及機制。
方法:本研究建立了TAC4周后的小鼠模型,并對miR-455進行于擾,測量小鼠血流動力學(xué)及心臟超聲數(shù)據(jù),對心肌組織進行HE和Masson染色觀察組織病理學(xué)變化;應(yīng)用PCR方法檢測肥大基因與纖維化基因;TUNEL法檢測細胞凋亡,
15、Westem blot分析凋亡蛋白;PCR與Western blot分析miR-455的target gene與蛋白表達。
結(jié)果:
1、miR-455在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)染
在尾靜脈注射GFP的TAC后4周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的降低,而經(jīng)過尾靜脈注射miR-455前體的TAC后4周的小鼠體內(nèi)miR-455有明顯的升高,TAC.GFP組與Sham組相比較,TAC.miR-455組與TAC.GFP組相比較,
16、均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。
2、miR-455對TAC后4周小鼠血流動力學(xué)及心臟超聲的影響
在TAC后的4周,與TAC后2周比較,雖然BP,LVESP,心重體重比及心肌細胞橫截面積無明顯變化,但觀察到LVEDP增高,LVAWd變薄,LVIDd變大,EF下降(P<0.05),說明這些小鼠發(fā)生了明顯的心肌重塑。但在TAC.miR-455組雖然LVAWd有所變?。≒<0.05),但LVIDd并未見到明顯的擴大(P
17、>0.05),EF也無明顯下降,也就是說,經(jīng)過miR-455干擾的小鼠心肌依然保持著心肌肥厚的狀態(tài)。這些結(jié)果暗示出miR-455可以阻止TAC4周后的心肌重塑。
3、miR-455對心肌肥厚基因的影響
4周時,和Sham組相比較,TAC.GFP組和TAC.miR-455組小鼠心肌組織中Anf, Acta1和Myh7有進行性上升(P<0.05),但有一個現(xiàn)象值得注意,Myh7的表達在TAC.GFP組超過了TAC.miR
18、-455組(P<0.01)。
4、miR-455對心肌纖維化的影響
心肌組織切片Masson染色顯示:Sham組可見少量膠原纖維散在分布于心肌細胞間隙中,呈現(xiàn)藍色,心肌細胞呈紅色;TAC.GFP組較之于Sham組心肌膠原纖維明顯增加,而TAC.miR-455組較之于TAC.GFP組心肌膠原纖維卻有顯著地減少。對于代表心肌纖維化的基因Tgfβ1和Ctgf,雖然較之于Sham組,在TAC.GFP組和TAC.miR-455
19、組的表達都有明顯上升,但在4周時,Tgf1和Ctgf在TAC.miR-455組的表達要低于在TAC.GFP組的表達(P<0.01)。說明miR-455可以減輕TAC4周后的心肌重塑。
5、miR-455抑制心肌細胞凋亡
經(jīng)過TUNEL染色,TAC.GFP組凋亡細胞明顯增多,而TAC.miR-455組凋亡細胞較之于TAC.GFP組有明顯下降。通過Western blot分析,我們檢測了抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白B
20、ax,結(jié)果顯示,TAC.miR-455組較之于TAC.GFP組抗凋亡蛋白Bcl-2有顯著上升,促凋亡蛋白Bax有明顯下降。
6、在TAC導(dǎo)致的心肌肥厚中鈣網(wǎng)蛋白是miR-455的target gene
我們進行了Calr和GRP78基因與蛋白的檢測,Western blot分析,TAC.GFP組Calr和GRP78升高,但經(jīng)過了miR-455的干擾,GRP78依然升高,而Calr卻有了明顯下降,說明Calr是miR-
21、455的target gene之一。PCR示Calr下降同時也有Calr mRNA的下降,說明miR-455對Calr的調(diào)節(jié)是通過降低mRNA來抑制蛋白翻譯。
小結(jié):長期壓力負荷后小鼠出現(xiàn)了失代償心衰的特征,表現(xiàn)為左室舒張末期壓力的明顯增高,因為心室腔出現(xiàn)擴大影響了心臟收縮功能,左室射血分數(shù)降低,出現(xiàn)明顯心肌纖維化和心肌細胞凋亡,同時伴隨纖維化基因與凋亡蛋白的改變。若長期上調(diào)miR-455,會降解靶rnRNA,使Calr降低,
22、會減輕心肌纖維化及凋亡,減緩了心力衰竭的進程。
結(jié)論:在本研究中我們得到以下結(jié)論:
短期壓力負荷后小鼠出現(xiàn)了代償性心肌肥厚的特征,表現(xiàn)為心室壁的增厚,心室腔的縮小以及心臟收縮功能的增強,病理學(xué)出現(xiàn)明顯心肌細胞增大。伴隨出現(xiàn)胎兒基因的重新激活。miR-455通過降解靶mRNA,Calr降低這條途徑,使得心肌細胞進一步增大,心肌肥厚更加明顯。我們可以通過對miR-455進行調(diào)節(jié)來減輕心肌肥厚。
長期壓力負荷后小
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