壓力負(fù)荷型心肌肥厚相關(guān)基因的克隆和功能研究.pdf

1、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文壓力負(fù)荷型心肌肥厚相關(guān)基因的克隆和功能研究姓名：李健申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：分子生物學(xué)與生物化學(xué)指導(dǎo)教師：陳蘭英2001.5.1中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)＆中國(guó)醫(yī)學(xué)科掌院博士研究生論文特異性，以8個(gè)看家基因作為陽(yáng)性對(duì)照來標(biāo)化mRNA的豐度，使其一次雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)墚a(chǎn)生成千上萬(wàn)個(gè)基因的基因表達(dá)譜。在反轉(zhuǎn)錄來自假手術(shù)及腹主動(dòng)脈綁扎(4w)的大鼠心肌組織RNA的過程中，使用a一”pdATP來進(jìn)行探針的標(biāo)記。然后將探針與微陣列尼龍膜

2、雜交，高嚴(yán)謹(jǐn)度洗滌后可經(jīng)放射自顯影分析雜交圖譜。通過所獲某種特定基因信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度值來比較其在對(duì)照及腹主動(dòng)脈綁扎的大鼠心肌組織中表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示有235個(gè)基因片段在兩組之間信號(hào)差別在3倍以上，其中包括TGFB受體III，rafARFclk2等重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子。并且運(yùn)用RACE方法成功獲得了這些基因的全長(zhǎng)序列，并將其克隆至PGEM—T載體上。眾所周知TGFB在心肌肥厚發(fā)生過程中是一種重要的自分泌、旁分泌因子。在本論文cDNA芯片

3、的☆果中觀察到TGFB受體III在腹主動(dòng)脈綁扎4周組表達(dá)明顯上調(diào)，為了研究其在心臟肥厚中的作用，本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建了反義TGFB受體III基因的重組載體，然后運(yùn)用陽(yáng)性脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)入心肌成纖維細(xì)胞內(nèi)并施以牽張應(yīng)力，利用RT～PCR技術(shù)觀察了反義TGFB受體III基因?qū)ζ渥陨肀磉_(dá)的影響：同時(shí)通過細(xì)胞計(jì)數(shù)、面積測(cè)定及流式細(xì)胞儀技術(shù)也觀察了反義基fJ丑在心肌成纖維細(xì)胞受到牽張后對(duì)細(xì)胞數(shù)目、大小及細(xì)胞周期等各項(xiàng)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：機(jī)械牽張能明顯誘