壓力負荷型心肌肥厚相關(guān)基因的克隆和功能研究.pdf

1、中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文壓力負荷型心肌肥厚相關(guān)基因的克隆和功能研究姓名：李健申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：分子生物學(xué)與生物化學(xué)指導(dǎo)教師：陳蘭英2001.5.1中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)＆中國醫(yī)學(xué)科掌院博士研究生論文特異性，以8個看家基因作為陽性對照來標化mRNA的豐度，使其一次雜交實驗?zāi)墚a(chǎn)生成千上萬個基因的基因表達譜。在反轉(zhuǎn)錄來自假手術(shù)及腹主動脈綁扎(4w)的大鼠心肌組織RNA的過程中，使用a一”pdATP來進行探針的標記。然后將探針與微陣列尼龍膜

2、雜交，高嚴謹度洗滌后可經(jīng)放射自顯影分析雜交圖譜。通過所獲某種特定基因信號的相對強度值來比較其在對照及腹主動脈綁扎的大鼠心肌組織中表達水平的差異。結(jié)果顯示有235個基因片段在兩組之間信號差別在3倍以上，其中包括TGFB受體III，rafARFclk2等重要的信號傳導(dǎo)分子。并且運用RACE方法成功獲得了這些基因的全長序列，并將其克隆至PGEM—T載體上。眾所周知TGFB在心肌肥厚發(fā)生過程中是一種重要的自分泌、旁分泌因子。在本論文cDNA芯片

3、的☆果中觀察到TGFB受體III在腹主動脈綁扎4周組表達明顯上調(diào)，為了研究其在心臟肥厚中的作用，本實驗首先構(gòu)建了反義TGFB受體III基因的重組載體，然后運用陽性脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)入心肌成纖維細胞內(nèi)并施以牽張應(yīng)力，利用RT～PCR技術(shù)觀察了反義TGFB受體III基因?qū)ζ渥陨肀磉_的影響：同時通過細胞計數(shù)、面積測定及流式細胞儀技術(shù)也觀察了反義基fJ丑在心肌成纖維細胞受到牽張后對細胞數(shù)目、大小及細胞周期等各項指標的影響。結(jié)果表明：機械牽張能明顯誘