miR-34通過自噬作用調(diào)控衰老的機制研究.pdf

1、微小RNA（microRNA，miRNA）是一類功能高度保守的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶基因mRNA的互補配對從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對多個靶mRNAs的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控。近年來研究表明，miRNA與發(fā)育、衰老、免疫和腫瘤等病理生理過程密切相關(guān)。在大鼠和線蟲microRNA芯片的研究中發(fā)現(xiàn)miR-34隨增齡表達(dá)上調(diào)，體外研究也證實miR-34能通過調(diào)控細(xì)胞周期等途徑加速細(xì)胞衰老的進(jìn)程。自噬是細(xì)胞通過溶酶體對自身受損結(jié)構(gòu)的吞噬降解過程，

2、對自噬作用的調(diào)控是p53、SIRT1等衰老相關(guān)基因調(diào)控壽命的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已有研究顯示miR-34參與p53和SIRT1的信號通路，提示自噬可能是miR-34參與衰老調(diào)控的重要機制。本研究旨在通過體內(nèi)外實驗闡明miR-34在衰老進(jìn)程中的確切作用及自噬在介導(dǎo)miR-34調(diào)控衰老作用中的分子機制。全文共分三個部分：
　　 第一部分：miR-34對線蟲壽命的影響
　　 通過real-t ime RT-PCR檢測大鼠和線蟲miR-3

3、4隨增齡的表達(dá)變化特點；并觀察miR-34缺失突變對線蟲壽命及應(yīng)激耐受性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與3月齡大鼠相比，24月齡wi star大鼠心臟、腦組織、肝臟、胸主動脈和腎臟miR-34a的表達(dá)分別增高2.36、1.71、1.85、3.45和2.14倍（p<0.05-0.01）。與1d線蟲成蟲相比，7d、9d和13d野生型N2株線蟲成蟲miR-34的表達(dá)顯著增高（p<0.05-0.01）。相關(guān)分析顯示，N2株線蟲miR-34的表達(dá)與增齡呈顯著

4、正相關(guān)（r=0.856，p<0.0001）。線蟲壽命分析結(jié)果顯示，miR-34缺失突變能延緩線蟲的衰老進(jìn)程，使線蟲壽命延長42％-62％（p<0.0001），并能改善線蟲對熱休克和氧化應(yīng)激的耐受性。同時發(fā)現(xiàn)，間斷禁食能使野生型N2株線蟲壽命延長37％（p<0.0001），但不影響miR-34缺失突變株線蟲的壽命。本部分研究結(jié)果顯示，miR-34能夠調(diào)控線蟲的衰老進(jìn)程，并提示其機制可能與限食、應(yīng)激等共同的機制-自噬作用有關(guān)。
　　

5、 第二部分：自噬在介導(dǎo)miR-34調(diào)控衰老中的作用研究
　　 利用RNAi敲除自噬相關(guān)基因，觀察抑制自噬對miR-34缺失突變株線蟲壽命的影響；并通過體外實驗檢測miR-34a（人miR-34主要轉(zhuǎn)錄本之一）對自噬的調(diào)控作用及SIRT1對該作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在野生型N2株線蟲，自噬基因RNAi組和對照質(zhì)粒組之間的壽命無顯著差異；而miR-34缺失突變株線蟲各RNAi組的壽命較對照質(zhì)粒組顯著縮短（P<0.0001）。體外實驗顯

6、示，miR-34a能抑制細(xì)胞自噬體標(biāo)志物L(fēng)C3II的表達(dá)（p<0.05）。與對照組相比，SIRT1 siRNA組LC3II的表達(dá)顯著下調(diào)（p<0.05），但SIRT1 siRNA和miR-34a inhibitor共轉(zhuǎn)染組LC3II的表達(dá)仍顯著升高（P<0.05）。本部分研究結(jié)果揭示，miR-34通過抑制細(xì)胞的自噬作用而調(diào)控衰老，且該作用不完全依賴SIRT1，提示自噬是miR-34調(diào)控衰老的重要機制。
　　 第三部分：miR-3

7、4通過Atg4B和Atg9A調(diào)控自噬的機制研究
　　 利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-34a可能的靶基因；通過體外實驗驗證miR-34a對靶基因表達(dá)的影響；進(jìn)一步采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測miR-34a與靶基因3'-UTR序列的相互作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miR-34a共有2904個可能的靶基因，其中Atg4B和Atg9A直接參與自噬體的形成過程。體外實驗顯示，miR-34a能下調(diào)Atg4B和Atg9A蛋白的表達(dá)（p<0.05-0.0

8、1），但不影響其mRNA的表達(dá)水平。雙熒光素酶檢測結(jié)果顯示，miR-34a能通過與Atg4B和Atg9A基因3'-UTR序列靶結(jié)合位點的相互作用，下調(diào)熒光素酶活性（p<0.05-0.01）。本部分研究結(jié)果證實，miR-34a能夠在轉(zhuǎn)錄后水平直接抑制Atg4B和Atg9A蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控自噬作用。
　　 綜上所述，本研究從整體動物水平驗證了miR-34能夠促進(jìn)衰老進(jìn)程，而自噬是介導(dǎo)miR-34調(diào)控衰老作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。并通過體外