耐輻射球菌中兩個(gè)抗氧化蛋白功能及類胡蘿卜素制備方法研究.pdf

1、耐輻射球菌是地球上最抗輻射的生物之一，其超強(qiáng)的極端環(huán)境抗性機(jī)制，一直是各國(guó)研究者的追蹤熱點(diǎn)。目前的研究認(rèn)為，耐輻射球菌的抗性機(jī)制可歸為保護(hù)、耐受和修復(fù)三個(gè)方面。在半個(gè)多世紀(jì)的研究中，科學(xué)家們也試圖尋找耐輻射球菌獨(dú)特的機(jī)制，來(lái)理解該細(xì)菌超強(qiáng)的輻射抗性。隨著近幾年自由基生物學(xué)的迅猛發(fā)展，研究者認(rèn)為耐輻射球菌的抗氧化機(jī)制是其具有超強(qiáng)電離輻射抗性的主要原因之一，并開(kāi)展了相關(guān)的研究工作。耐輻射球菌體內(nèi)已有許多抗氧化酶類、抗氧化蛋白、非酶類物質(zhì)被相

2、繼報(bào)道了，還不斷有新的成員被發(fā)現(xiàn)。我們認(rèn)為，開(kāi)展關(guān)于耐輻射球菌抗氧化機(jī)制的研究，不僅有助于我們更好地理解其獨(dú)特的逆境抗性，也將對(duì)人類疾病的防止與治療有一定的貢獻(xiàn)。本論文研究，以耐輻射球菌的氧化抗性機(jī)制為主線，完成了以下三部分的研究工作。 解螺旋酶RecG在生物體中擔(dān)任了重要的損傷修復(fù)功能，在假單孢菌中發(fā)現(xiàn)該蛋白與氧化抗性相關(guān)。我們通過(guò)基因敲除突變的方法，成功獲得耐輻射球菌解螺旋酶RecG功能缺陷的突變株。系列表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，d

3、rrecG基因的缺失引起菌株輻射抗性和氧化抗性的急劇下降，主要是引起菌株細(xì)胞提取物清除活性氧自由基的能力大大下降。同時(shí)，drrecG基因缺失的突變株MG中過(guò)氧化氫酶活性明顯下降，主要以KatB的活性下降最為顯著。脈沖場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，在氧化脅迫條件下，drrecG的功能缺陷引起菌株基因組的不穩(wěn)定性。以上結(jié)果說(shuō)明：drrecG參與了耐輻射球菌的抗輻射損傷和抗氧化的過(guò)程；在耐輻射球菌的抗氧化過(guò)程中，drrecG對(duì)維持基因組穩(wěn)定性和維持過(guò)氧化氫

4、酶活性水平具有重要貢獻(xiàn)。我們也研究了突變株MG的基因組轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)drrecG基因缺失引起參與能量代謝過(guò)程中的成員基因異常上調(diào)，核糖體蛋白基因被大量的抑制。我們認(rèn)為drrecG的缺陷，可能導(dǎo)致了耐輻射球菌內(nèi)部能量代謝的紊亂，這也是突變株MG在指數(shù)生長(zhǎng)期出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)遲滯現(xiàn)象的原因之一。在低濃度的過(guò)氧化氫脅迫條件下，drrecG基因的缺失激起了大量損傷修復(fù)蛋白、損傷識(shí)別蛋白、抗氧化蛋白的基因上調(diào)，表明突變株MG經(jīng)歷了極其嚴(yán)峻的生存考驗(yàn)。

5、上述結(jié)果再次證明drrecG基因是一個(gè)參與氧化抗性及損傷修復(fù)的重要因子。 dr1127基因的發(fā)現(xiàn)，源于我們實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的耐輻射球菌基因組芯片工作和蛋白質(zhì)組雙向電泳研究。在野生株R1經(jīng)過(guò)2,000Gy輻照處理后，dr1127基因及其產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的上調(diào)狀態(tài)。該基因的生物信息分析顯示，dr1127基因可能與一些毒性離子的抗性有關(guān)。我們通過(guò)敲除dr1127基因的突變株，研究該基因在耐輻射球菌體內(nèi)的生物學(xué)功能。dr1127基因缺陷株的逆境

6、存活率結(jié)果顯示，該基因的敲除引起菌株抵抗輻射損傷和氧化損傷的能力顯著下降，表現(xiàn)為過(guò)氧化氫極度敏感。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，以上現(xiàn)象的發(fā)生主要由于dr1127基因的缺失引起菌體細(xì)胞清除活性氧自由基的能力下降。菌體抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，dr1127基因突變株中過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性較野生株的分別下降了302.23％和20.18％。以上結(jié)果顯示，dr1127基因是耐輻射球菌體內(nèi)維持輻射抗性和氧化抗性的重要基因，其在抗氧化過(guò)程中的作用可能

7、部分來(lái)自其對(duì)抗氧化酶活性的調(diào)控。同時(shí)，我們?cè)诖竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化得到46KD的DR1127蛋白產(chǎn)物。在Fe<'2+>和H<,2>O<,2>組成的氧化損傷系統(tǒng)中，DR1127蛋白的加入可以有效地防止氧化損傷引起的DNA鏈缺口斷裂以及片段斷裂的情況。同時(shí)，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象：隨著DR1127蛋白添加量的增加，DNA在泳道中出現(xiàn)逐漸明顯的拖帶現(xiàn)象。蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DR1127蛋白可以結(jié)合雙鏈DNA，隨

8、著蛋白量的增加，DR1127蛋白可以實(shí)現(xiàn)完全綁定DNA的功能。以上結(jié)果很好地解釋了DR1127蛋白可能的生物學(xué)功能，在體外DR1127蛋白能夠與DNA結(jié)合形成致密的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物，通過(guò)這種方式可以有效防止自由基直接攻擊DNA分子，減少：DNA損傷情況。 作為維生素A的前體，類胡蘿卜素本身具有抗氧化以及其他多種生物學(xué)功能。隨著類胡蘿卜生理、藥理功能認(rèn)識(shí)的深入和在臨床醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)及化妝品工業(yè)等方面的應(yīng)用與研究，促進(jìn)了類胡蘿卜

9、素的市場(chǎng)發(fā)展和工業(yè)化生產(chǎn)。目前已有很多微生物被用作發(fā)酵制取類胡蘿卜素的研究報(bào)道，而耐輻射球菌作為一種原核微生物，具有生長(zhǎng)周期短(30h左右，霉菌需要72-96h)、菌體破碎較容易、提取方法簡(jiǎn)便、便于發(fā)酵控制等特點(diǎn)，這在很大程度上滿足了大規(guī)模生產(chǎn)類胡蘿卜素的要求。通過(guò)研究，我們找到了以豆餅粉作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基并適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充碳源(蔗糖)和氮源(硝酸鹽)取代了價(jià)格較高的的TGY(蛋白胨-葡萄糖-酵母膏)培養(yǎng)基，取得了很好的效果，而且從成本角度考慮更