哺乳動物Bax基因?qū)鸾z桃細胞凋亡和金絲桃苷合成的誘導(dǎo)作用及其機理研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、Bax基因是動物凋亡基因Bcl-2家族中的一員,具有促進動物細胞凋亡的作用。以往研究報道表明Bax基因可以誘發(fā)模式植物細胞過敏性反應(yīng)和凋亡。為了探討哺乳動物Bax基因?qū)λ幱弥参锛毎蛲龊图毎写紊x產(chǎn)物合成的影響,本文以本實驗室構(gòu)建保存的轉(zhuǎn)小鼠Bax基因的金絲桃細胞(雌二醇誘導(dǎo)型啟動子)為材料,研究了小鼠Bax基因?qū)鸾z桃細胞凋亡和金絲桃苷合成的影響,并初步探討了Bax基因誘發(fā)金絲桃細胞凋亡和金絲桃苷合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理,主要實驗結(jié)果如

2、下: 1、轉(zhuǎn)小鼠Bax基因金絲桃細胞系懸浮培養(yǎng)條件的優(yōu)化 將固體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)小鼠:Bax基因金絲桃愈傷組織接種到MS培養(yǎng)液中,為獲得最優(yōu)細胞生物量和金絲桃苷含量,對培養(yǎng)液(植物激素組成、pH值和蔗糖濃度)、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量等條件進行優(yōu)化,得到了金絲桃懸浮細胞系的最適培養(yǎng)條件:培養(yǎng)液為MS+1.5×10<'-5>mol·L<'-1>NAA+10<'-6>mol·L<'-1>BA+3%蔗糖,使用前pH值調(diào)至5.8,培養(yǎng)

3、溫度為25℃,搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm,接種量為3 g/50mL medium。并且在此培養(yǎng)條件下測得細胞生長周期為12 d。在優(yōu)化培養(yǎng)條件的過程中,對傳代種細胞進行Bax基因的:PCR鑒定篩選,最終獲得了生長速度較快、形態(tài)比較穩(wěn)定的金絲桃誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)小鼠Bax基因懸浮細胞系。 2、小鼠Bax基因?qū)鸾z桃細胞凋亡的影響及其機理的初步研究 Western blotting檢測結(jié)果表明,添加25 μmol·L<'-1>雌二醇(E

4、st)可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)小鼠:Bax基因金絲桃細胞中Bax的穩(wěn)定表達。轉(zhuǎn)小鼠:Bax基因金絲桃細胞經(jīng)Est處理后,21 h時胞外培養(yǎng)液pH值開始升高;用Sytox green特異性DNA染料對細胞進行染色,24 h時就能檢測到細胞的死亡,且隨著時間的延長死亡細胞數(shù)量逐漸增加,在60~72 h時可以觀察到明顯的細胞染色質(zhì)凝集、細胞核解體形成凋亡小體等形態(tài)學(xué)上典型的凋亡特征,而對照組細胞無上述特征。此結(jié)果表明小鼠Bax基因在金絲桃細胞中的誘導(dǎo)表達可

5、以誘發(fā)細胞凋亡。DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明,經(jīng)Est處理48 h后的轉(zhuǎn):Bax基因金絲桃細胞的基因組出現(xiàn)明顯的“’DNA Ladder”,而對照組細胞檢測不到“DNALadder”,表明小鼠Bax基因的誘導(dǎo)表達可以誘發(fā)核小體間的:DNA發(fā)生斷裂。此結(jié)果進一步證實小鼠Bax基因可以誘發(fā)金絲桃細胞凋亡。 為了探討小鼠Bax基因誘發(fā)金絲桃細胞凋亡的分子機理,本文測定了金絲桃細胞中一氧化氮(NO)的含量。試驗結(jié)果表明,Est處理后12

6、 h,轉(zhuǎn)基因金絲桃細胞的NO含量開始出現(xiàn)增加,并且在第25 h左右達到第一個高峰,隨后出現(xiàn)小幅下降,在大約33 h左右又開始快速增加并在40 h左右達到第二個高峰,而對照組細胞的NO含量未出現(xiàn)明顯變化。試驗結(jié)果表明,小鼠Bax基因的誘導(dǎo)表達可以誘發(fā)金絲桃細胞一NO進發(fā)。NO專一性淬滅劑cPTIO在淬滅NO進發(fā)的同時,也抑制了由Bax誘發(fā)的細胞凋亡,說明NO是參與Bax誘發(fā)金絲桃細胞凋亡所必需的信號分子。DPI是質(zhì)膜NADPH氧化酶的專一

7、性抑制劑,可以抑制細胞的氧化進發(fā)。本文試驗結(jié)果表明,DPI處理雖然不能抑制Bax誘發(fā)的金絲桃細胞凋亡和核DNA斷裂,但可以推遲細胞凋亡和“DNA Ladder”的出現(xiàn)時間,說明由質(zhì)膜NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化進發(fā)作用可能參與了Bax對金絲桃細胞凋亡的促進作用,但不是Bax誘發(fā)細胞凋亡的必需信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。 3、小鼠Bax基因?qū)鸾z桃苷合成的影響及其機理的初步研究 在未誘導(dǎo)Bax基因表達的前提下,轉(zhuǎn)小鼠Bax基因金絲桃懸浮細

8、胞和野生型金絲桃懸浮細胞,在細胞生長和金絲桃苷合成積累上沒有區(qū)別。在轉(zhuǎn):Bax金絲桃懸浮細胞生長周期的不同時間段添加Est進行Bax的誘導(dǎo)表達,發(fā)現(xiàn)細胞生長對數(shù)期末期(第9 d)為促進金絲桃苷合成積累的最佳誘導(dǎo)時期,第12 d收獲得鮮重為對照的94%,金絲桃苷含量達到了對照的2.15倍。在Bax誘導(dǎo)金絲桃苷合成的過程中,懸浮培養(yǎng)的金絲桃細胞發(fā)生了NO進發(fā)事件。NO專一性淬滅劑cPTIO可以有效的消除Bax誘發(fā)的NO進發(fā),并且在一定程度上

9、抑制了Bax誘導(dǎo)金絲桃苷的合成;外源NO也可以誘導(dǎo)金絲桃細胞中金絲桃苷的合成,cPTIO能抑制外源NO誘導(dǎo)金絲桃苷的合成。此結(jié)果表明NO介導(dǎo)了一條Bax誘導(dǎo)金絲桃苷合成的信號途徑。質(zhì)膜NADPH氧化酶的專一性抑制劑DPI對Bax誘導(dǎo)金絲桃苷的合成也有一定的抑制作用。通常,在植物細胞中,質(zhì)膜NADPH氧化酶介導(dǎo)的氧化進發(fā)的直接產(chǎn)物主要為H<,2>O<,2>。外源添加H<,2>O<,2>能夠有效的誘導(dǎo)金絲桃細胞中金絲桃苷的合成。過氧化氫酶(

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