金絲桃苷對低氧時大鼠認知功能的改善作用及其抗氧化應(yīng)激損傷機制.pdf

1、實驗背景:
　　高原低氧（低壓低氧）引起氧化應(yīng)激損傷，嚴(yán)重影響高原移居者的勞力與體力勞動能力，甚至引起高原衰退癥、高原心臟病等高原特發(fā)性疾病。中藥黃酮類成分具有抗氧化活性，金絲桃苷（Hyperoside, Hyp）是一種從天然植物中提取的黃酮醇苷類化合物（flavonoid glycoside compound）。近年來國內(nèi)外文獻均報道其具有多種藥理學(xué)活性，其中抗氧化活性越發(fā)受到研究者的重視。核因子E2相關(guān)因子2（Nuclear

2、factor erythroid-2-related factor2，Nrf2）屬于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族。在細胞內(nèi)自由基水平增高時，Nrf2從Keap1-Nrf2復(fù)合體中解離出來，進入細胞核內(nèi)，結(jié)合于多種抗氧化酶基因啟動子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件（Antioxidant Response Element，ARE），促進這些抗氧化蛋白的基因表達，調(diào)控細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，防止氧化應(yīng)激損傷。
　　實驗?zāi)康?
　　研究金絲桃苷（Hyp

3、eroside，Hyp）對低壓低氧誘導(dǎo)大鼠認知功能損傷的干預(yù)作用，并從抗氧化應(yīng)激損傷方面探討其作用機制，為闡明高原低氧引起認知能力下降的發(fā)生機制提供的理論依據(jù)，為預(yù)防高原環(huán)境引起的記憶功能損傷，促進機體高原習(xí)服提供新的藥靶與新的干預(yù)措施。
　　實驗方法：
　　1.將大鼠分為空白組與用藥組，空白組分為平原空白組和高原空白組，用藥組分為平原和高原Hyp低、中、高劑量組（10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg）。高原各組置

4、于模擬海拔6100 m低壓艙內(nèi)7天，平原各組置于常氧環(huán)境飼養(yǎng)7天，利用Morris水迷宮觀察Hyp對大鼠認知功能損傷的影響；HE染色觀察Hyp對低壓低氧引起的大腦海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞形態(tài)的影響。
　　2.利用試劑盒檢測海馬組織中的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）和過氧化氫酶（Catalase, CAT）的活性、以及丙二醇（Malondialdehyde, MDA）和還原型谷胱甘肽（Glutath

5、ione, GSH）的含量變化；qRT-PCR和免疫印跡分別檢測海馬中的Nrf2和血紅素氧化酶1（Heme Oxygenase-1, HO-1）的mRNA和蛋白表達水平。
　　3.在體外培養(yǎng)高分化的PC12細胞，將細胞分為空白組與用藥組，空白組分別為常氧空白組與低氧空白組，用藥組分別為常氧組與低氧組Hyp低、中、高劑量組（25、50、100μM）。常氧各組置于普通細胞培養(yǎng)箱（5％CO2,20%O2），低氧組各組利用缺氧培養(yǎng)箱（1%

6、O2）與 CoCl2（200μM）模擬PC12細胞缺氧模型。CCK-8測定Hyp對低氧引起PC12細胞活力的影響；ELISA試劑盒測定Hyp對低氧引起PC12細胞中MDA的含量，SOD和HO-1的活性的影響；qRT-PCR檢測Hyp對低氧引起PC12的Nrf2和HO-1的mRNA的影響；免疫印跡法檢測Hyp對PC12細胞中Nrf2的蛋白表達水平的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.低壓低氧暴露后大鼠在目標(biāo)象限的時間、距離和經(jīng)過平

7、臺的次數(shù)均顯著減少（p＜0.05）； Hyp干預(yù)后，低氧引起的這一效應(yīng)顯著被削弱。Hyp干預(yù)后，低氧暴露后的大鼠在目標(biāo)象限的時間、距離以及經(jīng)過平臺的次數(shù)均顯著高于低氧未用藥組（p＜0.05或p＜0.01）。海馬組織CA1區(qū)HE染色結(jié)果顯示，單純低壓低氧導(dǎo)致該區(qū)神經(jīng)細胞分布錯亂，細胞數(shù)量顯著減少（p＜0.05），神經(jīng)細胞出現(xiàn)損傷，而Hyp處理后低氧暴露的大鼠這些損傷明顯減輕。
　　2.低壓低氧引起海馬組織中MDA水平顯著增加，SOD

8、、CAT的活性和GSH含量均顯著減低（p＜0.05或p<0.01），而Hyp用藥組在低氧暴露后海馬組織中MDA水平顯著低于低氧未用藥組，SOD、CAT的活性和GSH含量均顯著高于低氧未用藥組（p＜0.05或p<0.01）；在低壓低氧環(huán)境下，Hyp用藥組（10、20、40 mg/kg） 均能顯著提高海馬組織中的 Nrf2和HO-1的 mRNA與蛋白水平（p＜0.05或p<0.01），并呈劑量依賴性關(guān)系。在常氧情況下，只有高劑量（

9、40 mg/kg）Hyp能顯著提高海馬組織中的Nrf2 mRNA與蛋白水平（p＜0.05），而中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）兩種劑量Hyp均能顯著提高海馬組織中的HO-1的mRNA與蛋白水平（p＜0.05或p＜0.01）。
　　3.體外高分化PC12細胞實驗發(fā)現(xiàn)：Hyp具有削弱低氧引起的細胞存活率下降（p＜0.05），并呈劑量依賴關(guān)系；在低氧環(huán)境下，Hyp具有顯著增加細胞SOD和HO-1的活性（p＜0.05或p<0

10、.01），顯著減少細胞中的MDA的含量（p＜0.05或p<0.01），同時在常氧情況下，Hyp也具有顯著增加SOD和HO-1的活性（p＜0.05）；低氧條件下，Hyp均能顯著提高PC12細胞Nrf2和HO-1的mRNA的表達（p＜0.05或p<0.01）。而在常氧情況下，Hyp中，高劑量也能顯著提高 PC12細胞Nrf2和HO-1的mRNA的表達（p＜0.05）；另外，不管在常氧或者低氧條件下，Hyp均能提高Nrf2的蛋白水平（p＜0.