WRKY家族調(diào)控植物抗逆信號(hào)途徑分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族主要存在于高等植物中，其功能主要與植物的防御反應(yīng)、逆境應(yīng)答、衰老信號(hào)和生長(zhǎng)發(fā)育等密切相關(guān)。 OsWRKY30是水稻中的一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY家族第Ⅰ組的成員。mGFP-OsWRKY30融合蛋白在水稻細(xì)胞中定位于細(xì)胞核中；OsWRKY30在體外能與W-box結(jié)合，具有WRKY轉(zhuǎn)錄因子的普遍特征；在酵母細(xì)胞中，OsWRKY30具有轉(zhuǎn)錄激活功能，通過(guò)不同長(zhǎng)度的截短突變體的研究確定

2、OsWRKY30的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在其N(xiāo)端。根據(jù)上述幾個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確定OsWRKY30是轉(zhuǎn)錄因子，具有WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。 進(jìn)一步研究了OsWRKY30在ABA和干旱誘導(dǎo)下的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)OsWRKY30受ABA和干旱誘導(dǎo)，說(shuō)明OsWRKY30參與了與ABA相關(guān)的干旱信號(hào)途徑；獲得了OsWRKY30的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在干旱條件下的篩選，發(fā)現(xiàn)OsWRKY30過(guò)表達(dá)株系比野生型有更強(qiáng)的耐旱能力。

3、 OsWRKY30同時(shí)還受SA、JA和病原菌等多種信號(hào)因子的誘導(dǎo)，從功能上提示了與MAPK可能的聯(lián)系，植物MAPK與防御反應(yīng)，逆境應(yīng)答等密切相關(guān)。同時(shí)，通過(guò)分析OsWRKY30蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)OsWRKY30的N端有1個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)SP位點(diǎn)(Serine-Proline site)，是潛在的MAPK磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證3個(gè)MAPK成員與OsWRKY30的相互作用，發(fā)現(xiàn)OsMAPK5a和OsWJUMK1

4、與OsWRKY30存在相互作用，而OsBWMK1與OsWRKY30沒(méi)有相互作用。 通過(guò)OsWRKY30不同截短突變體與OsMAPK5a和OsWJUMK1相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，OsWRKY30是通過(guò)SP位點(diǎn)與MAPK發(fā)生相互作用的，WRKY結(jié)構(gòu)域在WRKY轉(zhuǎn)錄因子與MAPK相互作用過(guò)程中起了重要作用，當(dāng)只含有OsWRKY30的N端SP1-6或SP2-5的區(qū)域與OsMAPK5a能發(fā)生相互作用，但作用相當(dāng)弱，而在加上WRKY結(jié)構(gòu)域后，這

5、種相互作用增強(qiáng)了很多。但OsWRKY30與兩個(gè)MAPK的相互作用過(guò)程中對(duì)WRKY結(jié)構(gòu)域的要求是不一樣的：對(duì)OsMAPK5a只需要1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，而對(duì)OsWJUMK1需要2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域都存在。通過(guò)熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，證明了OsWRKY30與OsMAPK5a在水稻細(xì)胞中存在相互作用，這是首次從體內(nèi)證明了WRKY轉(zhuǎn)錄因子與MAPK能相互作用。原核表達(dá)了OsMAPK5a和OsWRKY30(1-618aa部分)，體外磷酸化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了OsWRKY

6、30能被OsMAPK5a磷酸化。這樣從不同方面驗(yàn)證了OsWRKY30是MAPK的底物。 對(duì)OsWRKY30的N端富含SP位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)域在Gengbank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索，發(fā)現(xiàn)了28個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子都含有此結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其中最保守的5個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基命名該結(jié)構(gòu)域?yàn)镾PTTG結(jié)構(gòu)域(SPTTG domain)。從擬南芥和水稻轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)中補(bǔ)充了4個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，總共獲得32個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有SPTTG結(jié)構(gòu)域。這32個(gè)WRKY轉(zhuǎn)

7、錄因子都屬于WRKY家族中最保守的第Ia組。進(jìn)一步克隆了其中的7個(gè)，分別是擬南芥中5個(gè)、水稻中2個(gè)，加上OsWRKY30一共是8個(gè)。研究了這8個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子與MAPK的相互作用。OsMAPK5a與8個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在酵母細(xì)胞中都能相互作用，通過(guò)β-gal活性檢測(cè)以及觀察在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上生長(zhǎng)情況，比較了OsMAPK5a與8個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在酵母細(xì)胞中相互作用的強(qiáng)度，其中OsMAPK5a與AtWRKY2

8、、AtWRKY20、OsWRKY30、OsWRKY53和OsWRKY80相互作用較強(qiáng)，而與AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33作用較弱。OsWJUMK1與AtWRKY2、AtWRKY20、OsWRKY30和OsWRKY80相互作用較強(qiáng)，但與OsWRKY53不作用，與AtWRKY25、AtWRKY26和AtWRKY33作用較弱?？寺×薕sMAPK5a在擬南芥中同源的MAPK：AtMAPK3。研究了AtMAPK3與8個(gè)WRK