利用體細胞和胚胎干細胞克隆兔的研究.pdf

1、體細胞克隆技術(shù)，及其與基因打靶技術(shù)的結(jié)合為哺乳動物的遺傳工程和基因組保存提供了新的機遇和方法。兔是一種常用的實驗動物，發(fā)展能夠從長時間培養(yǎng)的細胞系獲得克隆兔的技術(shù)，一直是兔克隆技術(shù)研究的熱點，也是一直未攻克的難題。本試驗針對這一問題進行了研究，在世界上獲得首例來自皮膚成纖維細胞的克隆兔，以及首例來自兔胚胎干細胞的克隆兔。 通過對不同激活條件和培養(yǎng)條件的研究，發(fā)現(xiàn)兩次電擊和化學(xué)激活能夠較好的激活兔M Ⅱ期卵母細胞，B2培養(yǎng)液是適

2、合兔孤雌胚胎發(fā)育的培養(yǎng)液。 通過對兔耳部皮膚組織的體外培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇的實驗研究，建立了兔成纖維細胞的培養(yǎng)和保存體系。在不同處理后的細胞周期的研究中發(fā)現(xiàn)血清饑餓培養(yǎng)不能顯著提高兔成纖維細胞GO/G1期細胞的比例。 在核移植試驗中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過血清饑餓培養(yǎng)的成纖維細胞的克隆胚胎，比未經(jīng)血清饑餓培養(yǎng)的成纖維細胞的克隆胚胎在胚胎發(fā)育率上有顯著的提高。將來源于血清饑餓培養(yǎng)的成纖維細胞的467枚克隆胚胎移植給20只假孕母兔，結(jié)果

3、8只妊娠到期分娩，其中5只自然分娩出9只小兔，但它們在出生后十天內(nèi)陸續(xù)死亡。另外3只假孕母兔經(jīng)剖腹產(chǎn)分娩5只小兔，其中3只存活至成年，2只有正常繁殖能力。微衛(wèi)星分析證明3只克隆兔的遺傳物質(zhì)和供體細胞兔一致。這說明利用經(jīng)過長時間培養(yǎng)的成纖維細胞能獲得有繁殖能力的克隆兔。 在利用兔胚胎干細胞進行克隆兔的實驗中發(fā)現(xiàn)，兔胚胎干細胞不適合直接用于核移植。分化后的胚胎干細胞用于核移植可以顯著的提高克隆胚胎的囊胚率。將421枚胚胎干細胞克隆