基于DNA高級結(jié)構(gòu)的酶功能基組裝研究和DNA的新功能.pdf

1、DNA鏈之間的精確識別和獨(dú)特的高級結(jié)構(gòu)決定了其可以作為優(yōu)秀的自組裝分子。在不影響DNA結(jié)構(gòu)的這些特性的前提下,引入活性功能基,開發(fā)新功能,創(chuàng)建一類新型的生物功能分子?；谶@一指導(dǎo)思想,本課題以DNA高級結(jié)構(gòu)(B-DNA;G-四股螺旋結(jié)構(gòu))為模型,以絲氨酸蛋白酶、核糖核酸酶A、天冬氨酸蛋白酶活性中心的三維結(jié)構(gòu)及其催化機(jī)制為基本參照模板,將咪唑基以5-咪唑乙烯基-2’-脫氧尿苷(1),5-咪唑乙基-2’-脫氧尿苷(7)的形式、羥基以5’-羥

2、乙基-2’-脫氧尿苷(2)的形式、和羧基以5-羧甲基-2’-脫氧尿苷(10)和5-羧乙基-2’-脫氧尿苷(11)的形式分別引入這些DNA高級結(jié)構(gòu)中,開展了以下三部分工作:1)基于B-DNA模型的羧酸酯水解過程的模擬;2)基于G-四股螺旋結(jié)構(gòu)的具有磷酸酯水解功能的新型人工酶設(shè)計;3)基于B-DNA模型的具有肽裂解功能的新型人工酶設(shè)計。分別以乙酸對硝基酚酯(PNPA)、2-羥丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)以及BACE1天然底物和短肽為靶

3、進(jìn)行了相應(yīng)的酶學(xué)活性評價,并研究了其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系,初步探討了其催化機(jī)制。
　　1)基于B-DNA模型的羧酸酯水解過程的模擬
　　通過在B-DNA分子上進(jìn)行咪唑基和羥基的組裝,共設(shè)計合成了14種不同結(jié)構(gòu)的功能化DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),通過活性評價,篩選出最有效的組合LK-JC-02[5’-d(CGG CCT1A1 CGC GC)-3’,3’-d(GCC GGAA1A GCG CG)-5’],298 K,在緩沖液(50 mM[HEP

4、ES],50 mM MgCl2,pH7.2)中將乙酸對硝基酚酯(PNPA)的水解速率提高123倍,并且表現(xiàn)出一系列類似天然酶的典型特征:符合天然酶Michaelis-Menten動力學(xué)行為特征;表現(xiàn)出天然酶的多重催化轉(zhuǎn)化的能力;存在酶系催化過程中兩個效應(yīng)的平衡,二級速率常數(shù)k2隨pH變化曲線呈鐘形。通過咪唑基和羥基在不同位點(diǎn)的組裝,研究了其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系:催化活性的高低不僅僅與咪唑基的個數(shù)有關(guān),還與咪唑基組裝的有效性有關(guān);同一條鏈上的兩

5、個咪唑基之間具有較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng);互補(bǔ)鏈上的兩個咪唑基之間的協(xié)同效應(yīng)較弱;而且催化過程對Mg2+不具有依賴性。這些結(jié)果有力地驗證了以B-DNA高級結(jié)構(gòu)為模型進(jìn)行新型人工酶設(shè)計的可行性,開發(fā)了一類全新的生物大分子模擬體系,為基于生物大分子模型的新型人工酶的設(shè)計提供了新的選擇,同時也為研究羧酸酯水解過程的機(jī)理打下了基礎(chǔ)。
　　2)基于G-四股螺旋結(jié)構(gòu)的具有磷酸酯水解功能的新型人工酶的設(shè)計
　　利用核苷類似物1和7在G4螺旋的序列5

6、’-d(TGG GAG)中引入了咪唑基,以2-羥丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)作為裂解磷酸二酯鍵的模型底物,在303K,于緩沖液(50mM[HEPES],100mM KCl,pH7.0)中進(jìn)行活性測定,發(fā)現(xiàn)LK-JC-19[5’-d(1GGGAG)]對2-羥丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)具有一定的催化活性?？疾炝薓g2+,Mn2+,Ca2+對LK-JC-19的協(xié)同作用,這些金屬離子的加入,均使LK-JC-19的催化活性有所提高,

7、其中Mg2+的協(xié)同作用是最好的。303K,在緩沖液體系(50 mM[HEPES],50mM MgCl2,100mM KCl,pH7.0)中,LK-JC-19將2-羥丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)的水解速率提高三個數(shù)量級(kcat/kuncat=2590),并且表現(xiàn)出一系列類似天然酶的典型特征:具有天然酶類似的Michaelis-Menten動力學(xué)行為;能夠以催化量的劑量發(fā)揮催化作用;與天然酶的催化系統(tǒng)類似,催化過程中存在兩個效應(yīng)的平

8、衡即催化速率和活性中心與底物親和性的平衡。就所了解的文獻(xiàn)報道的結(jié)果,對于以2-羥丙基-4-硝基酚磷酸酯(HPNP)為靶的催化系統(tǒng),設(shè)計的人工酶LK-JC-19是基于功能基組合策略中催化活性最好的低分子量人工酶,催化效率比同類酶設(shè)計中活性最好的人工酶要高1個數(shù)量級,達(dá)到了某些金屬酶催化系統(tǒng)的催化水平。為進(jìn)一步優(yōu)化功能基的設(shè)計,獲得更高效率的新功能分子打下了基礎(chǔ)。
　　3)基于B-DNA高級結(jié)構(gòu)的具有肽裂解功能的新型人工酶設(shè)計

9、　　利用含羧基功能基的核苷類似物合成了8條含羧基功能基的DNA序列,通過B-DNA獲得了多個羧基之間的組合。嘗試了BACE1天然底物以及人工合成肽段底物的裂解反應(yīng),在現(xiàn)有條件下均未取得預(yù)期結(jié)果。
　　在合成含功能基的DNA序列中,改進(jìn)了5-咪唑乙烯基-2’-脫氧尿苷的合成條件,評價了各個功能基引入DNA高級結(jié)構(gòu)后,對高級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的影響。
　　總之,以上結(jié)果顯示,DNA作為一類優(yōu)秀的自組裝分子,是完全可以作為設(shè)計和承載功能