一個(gè)新的低氧應(yīng)激反應(yīng)基因NDRG2的確定及其功能的初步研究.pdf

1、人源NDRG2(又名SYLD或KIAA1248)是我室在1999年利用基于PCR的消減雜交技術(shù)進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤與正常腦組織的基因表達(dá)差異研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)低表達(dá)的新基因[GenBank登錄號(hào)AF159092][1]，其mRNA全長(zhǎng)為2024bp,編碼一個(gè)含有357個(gè)氨基酸殘基、分子量約41kDa的功能未知蛋白。該基因染色體定位在14q11.2，含有16個(gè)外顯子，15個(gè)內(nèi)含子。由于該基因在氨基酸序列上與已發(fā)現(xiàn)的N-myc下游基因NDRG1(N

2、-mycdown-streamregulatedgene1)具有較高的同源性，將其命名為NDRG2。該基因在成人骨骼肌、腦和心肌中高表達(dá)，而在其他組織中低表達(dá)或不表達(dá)[2]。國內(nèi)外其他實(shí)驗(yàn)室也相繼報(bào)道了該基因。近些年來對(duì)NDRG2基因進(jìn)行了大量的研究，但其功能到現(xiàn)在仍然沒有明確。為了深入探索該基因的功能，我們利用PSA，Superfamily和3D-PSSM[3-4]等軟件分別從Ndrg2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，空間構(gòu)象和折疊分類等方面進(jìn)行預(yù)測(cè)

3、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ndrg2在結(jié)構(gòu)上(19-298位氨基酸)與α/β水解酶類蛋白具有高度的同源性，而α/β水解酶家族包括多種細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的酶類[5]，提示該基因可能參與氧化應(yīng)激。通過對(duì)NDRG2啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行相關(guān)軟件的分析，我們找到了三個(gè)可能的HRE(HypoxiaReactionElement)位點(diǎn)。另外，Ndrg2與Ndrg1有很高的同源性，而Ndrg1與細(xì)胞的低氧應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，推測(cè)Ndrg2可能也參與了低氧應(yīng)激反應(yīng)。為了驗(yàn)證上述推測(cè)，

4、我們以A549細(xì)胞系為研究對(duì)象，給予該細(xì)胞低氧及其模擬類似物(CoCl2、NiCl2)刺激，通過半定量RT-PCR和Western-Blot方法檢測(cè)，觀察到NDRG2隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平均逐漸升高。另外，為了避免細(xì)胞特異性的存在，我們又選取HepG2和SkBR-3兩株細(xì)胞系，觀察到了同樣的現(xiàn)象。初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Ndrg2與低氧應(yīng)激存在一定的聯(lián)系。在低氧應(yīng)激反應(yīng)過程中，HIF-1分子作為最主要的應(yīng)激反應(yīng)分子和轉(zhuǎn)錄因

5、子，調(diào)控著其下游許多低氧應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)(如VEGF和EPO等)。受HIF-1分子調(diào)控的基因其啟動(dòng)子區(qū)或增強(qiáng)子區(qū)普遍存在一個(gè)或數(shù)個(gè)低氧反應(yīng)元件HRE，我們通過生物信息學(xué)分析在NDRG2的啟動(dòng)子區(qū)找到了3個(gè)可能的HRE位點(diǎn)，這些HRE位點(diǎn)的存在，使我們進(jìn)一步推測(cè)NDRG2基因在低氧刺激后表達(dá)水平的升高，可能是受HIF-1分子調(diào)控的。我們將外源的HIF-1a分子轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)隨著外源HIF-1a分子表達(dá)水平的升高，Ndrg

6、2的表達(dá)水平也逐漸升高；同時(shí)我們又構(gòu)建了HIF-1a分子的干涉載體，封閉HIF-1a分子后，再給予低氧刺激，Ndrg2的誘導(dǎo)升高水平明顯降低；為了尋找NDRG2基因啟動(dòng)子區(qū)的功能性HRE位點(diǎn)，圍繞3個(gè)可能的HRE位點(diǎn)我們構(gòu)建了一系列的突變體，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)3個(gè)HRE位點(diǎn)在HIF-1調(diào)控NDRG2表達(dá)水平升高的過程中均發(fā)揮著一定的作用。另外，在實(shí)驗(yàn)過程中，我們又發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常有意義的現(xiàn)象：當(dāng)細(xì)胞處于靜息狀態(tài)沒有任何刺

7、激時(shí)，Ndrg2表達(dá)量低且主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)給予細(xì)胞低氧刺激后，Ndrg2的表達(dá)量逐漸升高同時(shí)可觀察到其轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核。Ndrg2低氧刺激前后轉(zhuǎn)位現(xiàn)象的發(fā)生，對(duì)其功能的研究具有重要的提示作用。明確了Ndrg2參與低氧應(yīng)激反應(yīng)的這一事實(shí)，但該基因在這一過程中具體發(fā)揮著什么樣的作用又成為我們關(guān)注的重點(diǎn)。我們構(gòu)建了三個(gè)NDRG2的干涉載體，篩選出干涉效果最好的進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，獲得了1個(gè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。通過MTT和FCM檢測(cè)，觀察到在低氧刺激條件下

8、，干涉NDRG2基因的細(xì)胞其周期發(fā)生明顯的阻滯，細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯變慢。提示Ndrg2在低氧應(yīng)激反應(yīng)過程中具有促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)行，維持細(xì)胞基本正常生理功能，最終對(duì)處于低氧狀態(tài)的細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。綜上所述，我們首次提出了NDRG2參與低氧應(yīng)激反應(yīng)的假設(shè)，并通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這一推測(cè)。進(jìn)一步提出并證明NDRG2受HIF-1分子調(diào)控，參與低氧應(yīng)激反應(yīng)的分子基礎(chǔ)。發(fā)現(xiàn)Ndrg2分子低氧刺激前后的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象，為深入研究其功能提供了重要的線索。通過RNA