NDRG2參與全腦缺血后NF-κB介導的炎癥反應.pdf

1、全球每年約有600余萬人死于腦中風，其致殘率亦居高不下，給社會和家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔。大量研究表明炎癥在缺血性神經(jīng)損傷的病理進程中發(fā)揮了重要作用，加劇神經(jīng)損傷。抑制腦缺血損傷后炎性反應顯著減少神經(jīng)功能缺失，發(fā)揮腦保護作用。
　　以往對腦缺血再灌注損傷后炎性反應的研究大多聚焦于小膠質細胞上。近年來，一些研究證實，神經(jīng)細胞中數(shù)量最多的星形膠質細胞在缺血性腦損傷后的炎性反應中發(fā)揮關鍵作用，并成為腦缺血損傷治療的新靶點。我們前期研

2、究發(fā)現(xiàn)特異性表達于星形膠質細胞內的 NDRG2在局灶性腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮關鍵作用，下調NDRG2的表達顯著抑制星形膠質細胞活化，減少神經(jīng)細胞凋亡。但NDRG2是否參與了全腦缺血再灌注損傷后的炎性反應進程，尚需深入探討。
　　本研究旨在探索特異性表達于星形膠質細胞內的NDRG2是否參與了全腦缺血再灌注損傷后NF-κB介導的炎性反應通路，為腦缺血損傷后抗炎治療提供新的分子靶點。
　　實驗一、NDRG2和NF-κB細胞及亞細胞

3、定位
　　目的：明確NDRG2和NF-κB在海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞的表達與定位
　　方法：
　　1.為明確NDRG2和NF-κB在海馬CA1區(qū)細胞定位，將6只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組和GCI組。運用免疫熒光染色檢測NDRG2和NF-κB的細胞定位情況。
　　2.為明確原代星形膠質細胞中NDRG2和NF-κB表達及定位，利用免疫熒光染色檢測原代星形膠質細胞中NDRG2和NF-κB的表達與定位。
　　結

4、果：
　　1.免疫熒光結果顯示，NDRG2和NF-κB在海馬CA1區(qū)分別與星形膠質細胞特異性蛋白標記物膠質纖維酸性蛋白（glial Fibrillary acidic protein，GFAP）存在大量共標，進一步觀察發(fā)現(xiàn)NDRG2和NF-κB亦有大量重疊；與Con組相比，GCI/R組NDRG2和NF-κB共標細胞數(shù)量明顯增加。
　　2.免疫熒光結果顯示，原代星形膠質細胞中高表達NDRG2和NF-κB；進一步觀察發(fā)現(xiàn)，NDR

5、G2和NF-κB主要集中于細胞胞質中，與細胞核幾乎不存在共標。
　　結論：NDRG2和NF-κB高表達于海馬CA1區(qū)星形膠質細胞中，主要集中于細胞胞質中，并存在大量共定位，在缺血損傷后共定位明顯增加。
　　實驗二、缺血損傷后NDRG2和NF-κB表達增加，炎癥因子釋放增加
　　目的：觀察缺血損傷后海馬CA1區(qū)NDRG2、NF-κB蛋白及炎癥因子表達變化
　　方法：
　　1.為檢測缺血損傷后海馬CA1區(qū)NDR

6、G2、NF-κB蛋白及炎癥因子時間表達變化，將32只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組和GCI/R組，其中GCI/R組再分為7組，即GCI/R0h、GCI/R2h、GCI/R6h、GCI/R12h、GCI/R24h、GCI/R48h、GCI/R72h。在缺血再灌注0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h取雙側海馬CA1區(qū)腦組織，用Western blot檢測NDRG2和NF-κB蛋白表達變化，用ELISA檢測炎癥因子TNF-α、

7、IL-6、IL-1β表達情況。
　　2.為檢測OGD后原代星形膠質細胞中NDRG2、NF-κB蛋白時間表達變化及炎癥因子分泌情況，將原代星形膠質細胞隨機分為Con組和OGD/R組，其中OGD/R組再分為OGD/R0h、OGD/R2h、OGD/R6h、OGD/R12h、OGD/R24h組。在復氧復糖0h、2h、6h、12h、24h分別收集細胞和培養(yǎng)液，用Western blot檢測NDRG2和NF-κB蛋白表達變化，用ELISA檢測

8、炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β分泌情況。
　　結果：
　　1.Western blot結果顯示，在全腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)NDRG2和NF-κB蛋白表達顯著增加(*P＜0.05,**P＜0.01)，持續(xù)至再灌注72h；ELISA結果顯示，與對照組相比，缺血再灌注后海馬CA1區(qū)炎癥因子TNF-α、IL-6表達顯著上調(*P＜0.05,**P＜0.01,***p＜0.001)，而炎癥因子IL-1β表達無顯著差異。<

9、br>　　2.Western blot結果顯示，原代星形膠質細胞內NDRG2和NF-κB蛋白表達在OGD/R后持續(xù)升高，其中OGD/R0h和OGD/R24 h最為明顯(*P＜0.05,**P＜0.01)。ELISA結果顯示，在OGD/R后原代星形膠質細胞分泌的炎癥因子TNF-α和IL-6分別在OGD/R0h和OGD/R2h開始增加，持續(xù)到OGD/R24h(*P＜0.05,**P＜0.01,***p＜0.001)，而IL-1β僅在OGD/

10、R24h分泌增加（*P＜0.05）。
　　結論：全腦缺血再灌注損傷后海馬CA1區(qū)NDRG2和NF-κB蛋白表達顯著上調，炎癥因子TNF-α和IL-6分泌明顯增加，而炎癥因子IL-1β無顯著變化。原代星形膠質細胞OGD損傷后NDRG2和NF-κB蛋白表達及炎癥因子TNF-α和IL-6分泌明顯增加，而IL-1β僅在復氧復糖24h增加。
　　實驗三、抑制NF-κB下調NDRG2表達，減輕炎性反應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用
　　目的：

11、觀察NF-κB特異性抑制劑PDTC對全腦缺血再灌注損傷后NDRG2及炎癥因子TNF-α和IL-6表達或分泌的影響及其神經(jīng)保護效應。
　　方法：
　　1.為研究PDTC對全腦缺血再灌注損傷后NDRG2蛋白表達及炎癥因子TNF-α和IL-6分泌的影響，將24只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組、GCI/R1d組、GCI/R2d組，GCI/R3d組，進一步將各組隨機分為Vehicle組和PDTC組。PDTC組小鼠于結扎雙側頸總動脈

12、前20min經(jīng)腹腔給予PDTC，Vehicle組小鼠則給予等體積的生理鹽水。在再灌注不同時間點取小鼠雙側海馬CA1區(qū)組織，用Western blot檢測NDRG2蛋白表達變化，用ELISA檢測炎癥因子TNF-α和IL-6水平。
　　2.為研究PDTC對OGD后星形膠質細胞中NDRG2蛋白表達及炎癥因子TNF-α和IL-6水平的影響，體外行原代星形膠質細胞培養(yǎng)，建立OGD模型模擬腦缺血損傷。OGD前給予PDTC預處理1h，在復氧復糖

13、不同時間點（OGD/R12h，OGD/R24h）收集細胞及培養(yǎng)液。用Western blot檢測細胞中NDRG2蛋白表達變化，用ELISA檢測培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α和IL-6水平。
　　3.為觀察PDTC對全腦缺血損傷后神經(jīng)細胞的保護作用，將27只成年雄性C57小鼠隨機分為Con組，GCI/R組，PDTC+GCI/R組，在再灌注3d或7d取腦組織進行HE染色，TUNEL染色和免疫熒光染色；離體實驗，給予原代星形膠質細胞PDTC

14、1h預處理后與原代神經(jīng)元進行共培養(yǎng)并立即行OGD處理，分別用流式細胞儀和Western blot檢測OGD/R24h神經(jīng)元凋亡指數(shù)與Cleaved-caspase3蛋白表達變化。
　　結果：
　　1.在非缺血狀態(tài)下，PDTC不影響海馬CA1區(qū)NDRG2蛋白的表達水平，然而，在全腦缺血再灌注損傷后PDTC顯著下調NDRG2蛋白表達(＃P＜0.05)；ELISA結果顯示，PDTC不影響非缺血狀態(tài)下海馬CA1區(qū)炎癥因子TNF-α和

15、IL-6水平，全腦缺血再灌注后，PDTC組炎癥因子TNF-α和IL-6水平顯著低于Vehicle組(＃P＜0.05)。
　　2. Western blot結果顯示，PTDC不影響生理狀態(tài)下星形膠質細胞內NDRG2表達，在OGD/R12h，OGD/R24h，PDTC明顯下調NDRG2蛋白水平(＃P＜0.05)；ELISA結果發(fā)現(xiàn)PDTC不影響生理狀態(tài)下炎癥因子TNF-α和 IL-6分泌，而OGD損傷后，PDTC顯著降低培養(yǎng)液中炎癥因

16、子TNF-α和IL-6水平(＃P＜0.05)。
　　3. HE染色結果顯示，與Con組相比，GCI/R組海馬CA1區(qū)椎體神經(jīng)元胞體形態(tài)不規(guī)則，核深染、固縮，細胞嚴重受損，GCI+PDTC組海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元損傷明顯減輕；TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，與Con組相比，GCI/R組TUNEL陽性細胞數(shù)量明顯增加，PDTC顯著減少GCI后TUNEL陽性細胞數(shù)量(*P＜0.05)；GCI/R7 d行免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，GCI后 NeuN陽性細胞數(shù)

17、量明顯減少(**P＜0.01)，而GCI+PTDC組NeuN陽性細胞數(shù)量較GCI/R組顯著增加(＃＃P＜0.01)。流式細胞計數(shù)結果顯示，OGD后神經(jīng)元凋亡指數(shù)顯著增加(***p＜0.001)，PDTC明顯減少神經(jīng)元凋亡(＃＃＃p＜0.001)；Western blot結果顯示，與Con組相比，OGD/R組Cleaved-caspase3表達明顯增加(**P＜0.01)，PDTC顯著下調OGD損傷后神經(jīng)元內Cleaved-caspase

18、3蛋白水平(＃＃P＜0.01)。
　　結論：在缺血損傷后，PDTC下調星形膠質細胞內NDRG2表達水平，減輕炎性反應，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　實驗四、下調NDRG2表達減輕缺血損傷誘發(fā)的炎癥反應
　　目的：探討NDRG2在缺血損傷后炎癥反應中的作用
　　方法：
　　1.為驗證病病毒轉染的效能及效果，用熒光顯微鏡觀察慢病毒感染的星形膠質細胞系M1800細胞中表達GFP熒光蛋白細胞數(shù)量，用Western blo

19、t檢測NDRG2上下調細胞系中NDRG2蛋白表達水平。
　　2.為研究NDRG2在缺血損傷后炎癥反應中的作用，將NDRG2上下調細胞行OGD處理，在復氧復糖24h收集細胞培養(yǎng)液，用ELISA檢測培養(yǎng)液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平。
　　結果：
　　1.熒光結果顯示70-80％星形膠質細胞表達GFP熒光蛋白，Western blot結果顯示，NDRG2下調組NDRG2蛋白表達較對照組顯著減少（**P＜0

20、.01），而NDRG2上調組NDRG2蛋白表達明顯增加(＃P＜0.01)。
　　2.ELISA結果顯示，與Con相比，shRNA-Con組和LV-Con組炎癥因子水平無明顯差異；與shRNA-Con組相比，shRNA-NDRG2組炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β分泌顯著減少(*P＜0.05)；LV-NDRG2組炎癥因子TNF-α、IL-6水平較LV-Con組明顯增加(＃P＜0.05)，而炎癥因子IL-1β無顯著差異。