殼聚糖納米粒介導TGF-β1-miR-493靶向干預結直腸癌肝轉移的作用及機制研究.pdf

1、目的：探討殼聚糖（chitosan,CS)作為轉化生長因子-β1(transforming growth factor-P,TGF-β1)的藥物載體在結直腸癌（colorectal cancer, CRC)肝轉移中的作用及其機制的研宄。
　　方法：
　　(1)用不同序列的TGF-p1-siRNA處理小鼠結直腸癌細胞株CT26，Western blot篩選沉默效果最佳的TGF-p1-siRNA序列，用作后續(xù)研宄。（2)將三聚磷

2、酸鈉(tripolyphosphate, TPP)與CS通過離子凝膠法交聯(lián)成空白納米粒，探討配制成分的改變對其理化性質(zhì)的影響。（3)將 TGF-p1-siRNA與 CS/TPP結合，配制成一定粒徑的納米粒懸液，尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，驗證其肝靶向性及探討TPP對C S的修飾作用對肝靶向性的影響，以篩選出最佳的肝靶向性納米粒的配制條件。(4)用不同P H值的冰醋酸溶液溶解CS，配置CS/TPP/siRNA納米粒懸液，探討不同PH值對siRN

3、A包裹率的影響；將上述CS/TPP/siRNA懸液再次溶解在不同PH值的醋酸溶液中，探討PH值的改變對siRNA釋放率的影響。（5)將上述篩選的肝靶向性好、釋放率高的CS/TPP/siRNA納米粒懸液經(jīng)尾靜脈注射進C R C肝轉移模型小鼠體內(nèi)，探討其對C R C肝轉移的影響及作用機制。（6)將 TGF-p1siRNA體外瞬轉到CT26細胞株內(nèi)，分析CT26細胞株中TGF-P1相關miRNAs的表達圖譜，基因芯片篩選出上調(diào)倍數(shù)>2倍的mi

4、RNAs，采用qRT-PCR法驗證TGF-P1沉默的細胞株中和注射CS/TPP/TGF-p1siRNA納米粒的肝轉移組織標本中最有效的差異性miRNA(miR-493-5p)。(7)將篩選出的miRNA(miR-493-5p)的成熟體(mimics, M)體外瞬轉到CT26細胞中，采用qRT-PCR法檢測miR-493-5p的表達；采用MTT法檢測轉染后CT26細胞的體外增殖情況；用Transwell迀移實驗檢測轉后細胞的體外迀移能力的

5、改變。（8)將 CT26細胞皮下接種到裸鼠用于體內(nèi)實驗，瘤內(nèi)注射CS/TPP/M的納米粒懸液，通過對皮下成瘤的體積統(tǒng)計初步估計miR-493-5p對致瘤性的影響。(9)生物信息技術預測miR-493-5p的革巴基因，western b lo t對其進行篩選和驗證。
　　結果：
　　(1) Western blot結果顯示TGF-p1-mus-1998 siRNA在CT26細胞中的基因沉默效果最好。（2)馬爾文激光粒度儀結果顯

6、示，CS/TPP納米粒的粒徑和Z e ta電位主要隨著C S濃度的改變而改變。（3)250nm粒徑的CS/TPP納米粒有良好的肝臟靶向性，并且TPP修飾后，能夠增加納米粒的這一性能。（4) P H敏感性實驗結果顯示，在PH6.8這一接近腫瘤弱酸微環(huán)境的P H值下，納米粒的釋放率最高。（5)肝轉移模型小鼠在接受CS/TPP/siRNA尾靜脈注射后，比單純的CS/TPP和 siRNA組注射腫瘤抑制效果更好。（6) m iR N A芯片結果顯

7、示，TGF-p1-siRNA處理的CT26細胞株中6個miRNA(miR-10a-3p, miRNA-871-3p, miR-678, miR-493-5p*，miR-M1-7-3p和 miR-1983)過表達，其中 miR-493-5p和miR-1983經(jīng) qRT-PCR檢測 TGF-P1沉默的細胞株和組織后得到驗證。（7) qRT-PCR結果顯示，M顯著增加了miR-493-5p的表達；MTT結果顯示，經(jīng)M轉染的CT26細胞體外增殖

8、能力下降；Transwell結果顯示經(jīng)M轉染后CT26細胞的體外迀移能力下降。（8)經(jīng)CS/TPP/M瘤內(nèi)注射后的體內(nèi)實驗結果顯示，M組的腫瘤體積減小。（9)經(jīng)預測，miR-493-5p的候選靶基因有四個，分別為SPRK2(Serine/arginine protein-specific kinase2)、Pumilio2(pumilio RNA-binding family member2)、FUBP1(far upstream el

9、ement binding protein1)和Pescadillo1。經(jīng)驗證，Srpk2和 Pumilio2是miR-493-5p的有效革巴基因。
　　結論：
　　(1)通過對CS濃度的改變能配制出不同粒徑和Zeta電位的納米粒，其中250nm的經(jīng)過TPP修飾后的納米粒具有更好的肝臟靶向性。（2)在P H接近腫瘤微環(huán)境PH值的溶液中，納米粒的釋放率顯著增加，說明了其潛在的腫瘤靶向性。（3)CRC肝轉移模型的成瘤結果顯示，C

10、S/TPP/TGF-p1siRNA納米粒系統(tǒng)能夠抑制C T26細胞的體內(nèi)成瘤能力。（4) m iR N A芯片和qRT-PCR成功篩選出TGF-P1相關的miR-493-5p作為抑癌基因進行后續(xù)研宄。（5)在體外，miR-493-5p的M顯著增加miR-493-5p的表達，抑制CT26細胞的細胞活性和迀移能力。（6)在體內(nèi)，CS/TPP/M納米粒系統(tǒng)能抑制CT26細胞的致瘤性。（7) Srpk2和 Pumilio2是miR-493-5p