Sestrin 2在結(jié)直腸癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分：Sestrin2在結(jié)直腸癌中的表達及臨床意義
　　目的：研究檢測了sestrin2在人CRC組織和細胞株中的表達，同時分析sestrin2表達水平與患者臨床病理特征、生存時間之間的相關(guān)性，以探討其在CRC發(fā)生及發(fā)展中的可能作用。
　　方法：
　　1.免疫組織化學方法檢測sestrin2在237例CRC患者及對照組32例正常結(jié)腸粘膜、22例結(jié)腸息肉、30例結(jié)腸腺瘤、26例結(jié)腸癌癌旁組織標本中的表達情況，分析se

2、strin2異常表達與CRC患者臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　2.免疫印跡方法及熒光定量PCR分別檢測sestrin2在42例CRC患者及對照組19例正常結(jié)腸粘膜、20例結(jié)腸息肉、22例結(jié)腸腺瘤、26例結(jié)腸癌癌旁組織新鮮標本中的蛋白和mRNA表達水平，并分析sestrin2蛋白異常表達與臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　3.采用Kaplan-Meier生存分析研究sestrin2表達水平與CRC患者總體生存率/無病生存率（OS/

3、DFS）的關(guān)系，采用Cox回歸方法分析CRC患者的生存時間和影響生存時間的多種相關(guān)因素之間的關(guān)系。
　　4.免疫熒光及免疫印跡檢測sestrin2在CRC細胞株HT-29、SW480、SW620、LoVo與正常結(jié)腸粘膜細胞株FHC的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1. Sestrin2的表達主要位于細胞漿,在CRC組織中的表達陽性率為27.8％，在正常結(jié)腸粘膜、結(jié)腸息肉、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸癌癌旁組織中陽性率分別為87.5%、7

4、1.8%、80%和80.8%，Sestrin2在CRC組織中的表達顯著低于結(jié)腸非癌對照組(p<0.05)。sestrin2的低表達與CRC的TNM分期、淋巴結(jié)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲及肝臟轉(zhuǎn)移相關(guān)(p<0.05)。
　　2. Sestrin2 mRNA和蛋白表達水平在CRC組中均顯著低于對照組（p<0.05）,sestrin2蛋白的低表達與CRC的TNM分期、淋巴結(jié)浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵襲及肝臟轉(zhuǎn)移相關(guān)（p<0.05）。

5、>　　3.生存分析顯示sestrin2高表達的CRC患者總生存時間（OS）和無病生存時間（DFS）均顯著長于sestrin2低表達的CRC患者（p<0.05）。Sestrin2低表達與CRC不良預后相關(guān)（p<0.05），而且是CRC患者不良預后的獨立因素（p<0.05）。
　　4. Sestrin2的免疫熒光染色定位于細胞漿，在FHC細胞株中呈強表達，在HT-29和SW480細胞株中為中等表達，而在SW620和LoVo細胞株中為弱

6、表達。
　　5.與FHC細胞株相比較，sestrin2蛋白在HT-29、SW480、SW620以及LoVo中表達均顯著降低（p<0.05）。此外，sestrin2在SW620及LoVo細胞中的表達顯著低于HT-29和SW480（p<0.05）。
　　結(jié)論：與正常結(jié)腸粘膜、結(jié)腸息肉、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸癌癌旁組織相比，sestrin2在人CRC組織中呈低表達。與結(jié)腸正常粘膜FHC細胞比較，sestrin2在CRC細胞株HT-29、S

7、W480、SW620以及LoVo中表達均顯著降低。此外，sestrin2低表達與臨床不良預后相關(guān)，是CRC的一個獨立預后因素。
　　第二部分：Sestrin2過表達對結(jié)直腸癌增殖和凋亡的影響
　　目的：構(gòu)建sestrin2過表達慢病毒載體，觀察sestrin2基因過表達后CRC細胞增殖和凋亡的變化，并探討其可能作用機制。
　　方法：
　　1.構(gòu)建sestrin2過表達慢病毒載體，分別轉(zhuǎn)染CRC SW620、LoV

8、o細胞，運用熒光定量PCR和免疫印跡方法驗證各組細胞轉(zhuǎn)染后sestrin2過表達效率。
　　2.通過CCK-8法、細胞平板克隆實驗和流式細胞術(shù)分別檢測sestrin2基因過表達后CRC SW620和LoVo細胞的增殖和凋亡的變化情況。
　　3.免疫印跡方法檢測sestrin2在CRC SW620細胞中過表達對增殖、凋亡相關(guān)因子及信號傳導通路相關(guān)的蛋白表達水平的影響。
　　4. CRC SW620和LoVo細胞按不同干預

9、方式分為LV-NC+ DMSO組，LV-NC+Compound C（AMPKα1阻斷劑）組，LV-sestrin2+DMSO組以及LV-sestrin2+Compound C組，用CCK8法、流式細胞術(shù)檢測以上四組細胞增殖及凋亡情況。
　　5.在LV-NC組、LV-NC+ Compound C組、LV-sestrin2組以及LV-sestrin2+Compound C四組CRC SW620細胞中，用免疫印跡方法檢測增殖、凋亡相關(guān)蛋

10、白表達。
　　6. CRC SW620細胞接種裸小鼠后，觀察sestrin2過表達對CRC SW620細胞移植瘤生長的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與空白對照組（BC）和陰性對照組（LV-NC）相比，轉(zhuǎn)染過表達sestrin2慢病毒組（LV-sestrin2）中CRC SW620、LoVo細胞sestrin2 mRNA和蛋白表達水平均明顯增加（p<0.05）。
　　2.在CRC SW620、LoVo細胞中，與BC組

11、和LV-NC組相比， LV-sestrin2組中細胞增殖能力明顯減弱、克隆形成數(shù)目明顯減少（p<0.05），而凋亡率明顯增加（p<0.05）。
　　3.在CRC SW620細胞中，與BC組和LV-NC組相比，LV-sestrin2組中增殖效應蛋白 PCNA和凋亡抑制蛋白 survivin表達顯著降低（p<0.05）,而凋亡效應蛋白caspase3、caspase7和caspase9表達顯著增高（p<0.05）。此外，LV-sest

12、rin2組p-AMPKα1顯著增高(P<0.05)，而mTOR信號通路的p-mTOR、p-p70s6K則顯著降低(P<0.05)。
　　4.在CRC SW620、LoVo細胞中，與未干預組相比較，LV-sestrin2干預組中細胞存活率顯著降低、凋亡率顯著升高（ p<0.05），而Compound C干預組及LV-sestrin2+Compound C干預組中細胞存活率和凋亡率均無明顯變化（p>0.05）。
　　5.在CRC

13、 SW620細胞中，與未干預組相比較，LV-sestrin2干預組中 p-mTOR、p-p70s6K和 survivin蛋白均顯著降低（p<0.05），而Compound C干預組及LV-sestrin2+Compound C干預組中上述蛋白均無明顯變化（p>0.05）。
　　6.與LV-NC組相比，LV-sestrin2組裸鼠移植瘤生長速度減慢，瘤體重量顯著減小（p<0.05），且sestrin2蛋白增高。
　　結(jié)論：Se

14、strin2過表達能夠抑制CRC SW620、LoVo細胞的增殖和促進結(jié)腸癌細胞凋亡，抑制結(jié)腸癌皮下移植瘤生長。Sestrin2抑制結(jié)腸癌生長的作用可能與AMPK/mTOR/Survivin相關(guān)信號通路有關(guān)。
　　第三部分：Sestrin2過表達對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響
　　目的：觀察sestrin2基因過表達后對結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的影響，并探討其可能作用機制。
　　方法：
　　1. Sestrin2過表達慢病毒轉(zhuǎn)染SW

15、620、LoVo細胞后，運用Transwell小室檢測細胞遷移、侵襲、粘附能力的細胞行為學。
　　2.免疫印跡方法檢測sestrin2過表達后CRC SW620細胞中與侵襲相關(guān)的MMP2、MMP9、MMP14，與EMT（上皮間質(zhì)化）相關(guān)的E-cadherin、N-cadherin、vimentin以及p-P38、smad4的蛋白表達。
　　3. CRC SW620和LoVo細胞按不同干預方式分為LV-NC+ DMSO組，LV

16、-NC+ SB202190（p38 MAPK通路阻斷劑）組，LV-sestrin2+DMSO組以及LV-sestrin2+SB202190組，用Transwell小室檢測以上四組細胞遷移、侵襲、粘附能力的細胞行為學變化。
　　4.在LV-NC組、LV-NC+SB202190組、LV-sestrin2組以及LV-sestrin2+SB202190四組CRC SW620細胞中，用免疫印跡方法檢測侵襲、EMT相關(guān)蛋白水平變化的影響。

17、r>　　5.免疫組化方法檢測裸鼠移植瘤移中侵襲、EMT相關(guān)蛋白表達變化。
　　6.建立裸鼠CRC血道轉(zhuǎn)移模型，利用小動物活體成像系統(tǒng)檢測過表達sestrin2基因?qū)RC肝臟和肺轉(zhuǎn)移灶形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與空白對照組（BC）和陰性對照組（LV-NC）相比，轉(zhuǎn)染過表達sestrin2慢病毒組（LV-sestrin2）的CRC SW620和LoVo細胞株中細胞遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目以及粘附吸光度值均顯著降低（p<

18、0.05）。
　　2.在CRC SW620細胞中，免疫印跡檢測結(jié)果示，與BC組和LV-NC組相比，LV-sestrin2組中MMP2、MMP9以及N-cadherin均顯著降低（p<0.05）, E-cadherin顯著增高（p<0.05），而MMP14和vimentin無明顯變化（p>0.05）。此外，LV-sestrin2組中，p-p38MAPK蛋白顯著增高（p<0.05），smad4總蛋白無明顯變化（p>0.05），但是sm

19、ad4在細胞核中的表達顯著降低（p<0.05）。
　　3.在CRC SW620和LoVo細胞中，與LV-NC+ DMSO組相比較， LV-sestrin2+ DMSO組細胞的遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目以及粘附吸光度值顯著降低（p<0.05）。而LV-NC+SB202190組及LV-sestrin2+SB202190組細胞的遷移數(shù)目、侵襲數(shù)目以及粘附吸光度值均較LV-NC+ DMSO組無明顯改變（p>0.05）。
　　4.在CRC S

20、W620細胞中，與未干預組相比較，LV-sestrin2干預組中 MMP2、MMP9和核smad4蛋白均顯著降低（p<0.05），E-cadherin顯著增高（p<0.05）。而SB202190干預組及LV-sestrin2+SB202190干預組中上述蛋白均無明顯變化（p>0.05）。
　　5.在裸鼠移植瘤中，與LV-NC組相比較，LV-sestrin2組中sestrin2和E-cadherin免疫組化平均光密度值（MOD值）顯

21、著增高（p<0.05）， MMP2、MMP9和N-cadherin的MOD值顯著降低（p<0.05），MMP14、vimentin蛋白的MOD值無明顯改變（p>0.05）。
　　6.小動物活體成像系統(tǒng)結(jié)果顯示，LV-sestrin2組中肝臟轉(zhuǎn)移灶和肺轉(zhuǎn)移灶的綠色熒光強度較LV-NC組顯著減弱（p<0.05）。
　　結(jié)論：Sestrin2過表達能夠抑制CRC細胞的遷移、侵襲、粘附以及結(jié)腸癌細胞EMT，其作用可能與p38 MAP